程 燁 李天成 陳建偉 鄒淑娟 李 煌 李貴鳳

上頜擴弓是正畸治療中用來改善生長發(fā)育期兒童上頜骨橫向發(fā)育不足的常用手段[1]，因其治療效果的顯著性和治療結(jié)束后較高的復(fù)發(fā)率，一直以來是被學(xué)者們廣泛研究的臨床問題。人們試圖尋找一種可靠的方法來增加上頜擴弓治療后結(jié)果的穩(wěn)定性、減少擴弓量的復(fù)發(fā)。

在上頜擴弓過程中，腭中縫的骨改建是維持?jǐn)U弓效果穩(wěn)定性的關(guān)鍵，腭中縫成骨量不足或破骨量過多被認(rèn)為是導(dǎo)致上頜擴弓后復(fù)發(fā)的主要原因[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）灌胃干預(yù)可以在大鼠上頜擴弓過程以及去除擴弓裝置的復(fù)發(fā)階段中促進腭中縫的新骨形成、增強腭中縫的骨質(zhì)，從而減低上頜擴弓治療后的復(fù)發(fā)率、維持其穩(wěn)定性[3]。然而，LF 灌胃的作用機制尚不甚清楚。

OPG/RANKL/RANK 作用軸是細(xì)胞間調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞破骨活性的重要通路[4]。核因子KB 受體活化因子（receptor or activator of nuclear factor-KB，RANK）分布在破骨前體細(xì)胞膜上，通過與成骨細(xì)胞表達(dá)的核因子KB 受體活化因子配體（receptor or activator of nuclear factor-KB ligand，RANKL）結(jié)合活化破骨前體細(xì)胞。RANKL 與RANK 的作用受到骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的調(diào)節(jié)。OPG 也由成骨細(xì)胞表達(dá)，競爭性與RANK 結(jié)合，阻礙破骨細(xì)胞破骨分化[5]。去勢大鼠LF 干預(yù)實驗顯示LF 是通過上調(diào)OPG/RANKL 表達(dá)比例來抑制破骨細(xì)胞活性的[6]。故LF 可能通過OPG/RANKL/RANK 作用軸，在上頜擴弓過程中抑制腭中縫的破骨活動。

本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，進一步探究LF 在上頜擴弓及復(fù)發(fā)過程中對腭中縫骨吸收的影響和作用機制。實驗仍然采用LF 灌胃的方式對大鼠上頜擴弓及復(fù)發(fā)過程進行干預(yù)，觀察在此過程中LF 對OPG/RANKL/RANK 作用軸關(guān)鍵因子OPG、RANKL表達(dá)的影響，初步探究LF 影響破骨活動的作用機制。

資料和方法

1.動物處理及分組

16 只5 周齡雄性Wistar 大鼠（成都達(dá)碩實驗動物有限公司，中國），體重100±10g，SPF 級，用相同的基礎(chǔ)飲食、飲水飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 天后（D0），隨機分為2 組:單純擴弓組（EO），安裝擴弓裝置；擴弓+LF 組（E+LF），擴弓同時給予1g/kg/d LF溶液灌胃；每組8 只大鼠。7 天的上頜擴弓后（D7），每組隨機挑選4 只大鼠處死并獲取腭部標(biāo)本，其余大鼠去除口內(nèi)裝置即進入復(fù)發(fā)階段。復(fù)發(fā)7 天后（D14），處死剩余的每組4 只大鼠并獲取腭部標(biāo)本。本研究動物實驗經(jīng)四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院動物倫理委員會審查批準(zhǔn)。

大鼠擴弓裝置的安裝、LF 灌胃干預(yù)、腭部標(biāo)本的獲取和處理等實驗步驟已在本研究前期實驗發(fā)表的文章中有詳盡闡述。

2.免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后浸泡于抗原修復(fù)液（檸檬酸鹽修復(fù)液或EDTA 修復(fù)液） 中，水浴升溫至75℃后恒溫加熱50 分鐘。切片自然冷卻、浸洗，之后置于3%過氧化氫溶液中避光浸泡30 分鐘。浸洗、擦干切片，滴加抗原封閉劑（1%牛血清）將標(biāo)本完全覆蓋，37℃孵育1 小時。吸干抗原封閉劑，滴加1%牛血清稀釋的一抗:組織蛋白酶k（cathepsin k，CTSK）抗體、RANKL 抗體、OPG 抗體（Abcam 公司，美國），37℃孵育1 小時，4℃冰箱中過夜。陰性對照標(biāo)本不滴加一抗。浸洗、擦干切片，按照二抗ABC 試劑盒（Vector Laboratories 公司，美國）說明書，分別滴加二抗和顯色劑，分別37℃孵育1 小時后洗凈。擦干切片，滴加新鮮配置的DAB 顯色液，鏡下控制顯色時間，自來水終止顯色并清洗，部分染色蘇木素復(fù)染。

切片在普通光學(xué)顯微鏡（Nikon 公司，日本）下觀察并采圖。在相同大小的視野中（2048×2048 像素）對CTSK 陽性細(xì)胞進行計數(shù)，統(tǒng)計破骨細(xì)胞的數(shù)量。利用Image J 軟件（National Institutes of Health，美國）分別提取固定大小視野中（2048×2048 像素）的RANKL、OPG 的陽性表達(dá)區(qū)域，并且分別計算陽性表達(dá)區(qū)域面積占視野總面積的百分比。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

所有量化的實驗結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用SPSS 軟件（SPSS 公司，美國）對兩組或兩個時間點（D7、D14）之間的數(shù)據(jù)進行t 檢驗比較。P＜0.05 則被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1.CTSK 免疫組織化學(xué)染色

在兩個實驗組的大鼠標(biāo)本中，胞質(zhì)陽性染色的多核細(xì)胞即破骨細(xì)胞在腭中縫的分布情況相似:在D7 時多位于中縫兩側(cè)骨端的骨髓腔邊緣，少數(shù)分布在腭部骨板鼻腔側(cè)的骨膜下；而在D14 時則在中縫兩側(cè)的骨髓腔邊緣分布減少，而多位于鼻腔側(cè)的骨膜下（圖1）。破骨細(xì)胞進行計數(shù)結(jié)果顯示:在D7、D14 兩個時間點，E+LF 組大鼠腭中縫的破骨細(xì)胞都顯著少于EO 組（圖2A）。

2.RANKL 免疫組織化學(xué)染色

RANKL 的陽性顯色大部分位于腭中縫的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨膜細(xì)胞等的細(xì)胞質(zhì)中，少量位于這些細(xì)胞周圍的組織基質(zhì)中。這樣的組織分布特點在檢測的標(biāo)本之間都沒有顯著差異（圖3）。計算RANKL 陽性表達(dá)面積占比結(jié)果顯示，RANKL 的表達(dá)量在兩個時間點有相似的組間差異，即E+LF 組明顯多于EO 組（圖2B）。

3.OPG 免疫組織化學(xué)染色

OPG 在D7、D14 兩個時間點的組織表達(dá)規(guī)律與RANKL 極為相似，即對于所有標(biāo)本OPG 的陽性顯色大部分位于標(biāo)本腭中縫的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨膜細(xì)胞等細(xì)胞的胞質(zhì)中，少部分位于這些細(xì)胞周圍的組織基質(zhì)中（圖4）。計算視野中OPG 陽性表達(dá)面積的百分比結(jié)果表明:OPG 的陽性表達(dá)面積在D7、D14 兩個觀測點均為E+LF 組顯著大于EO 組（圖2C）。

圖2 免疫組織化學(xué)染色量化結(jié)果（柱頂豎條表示標(biāo)準(zhǔn)差；* 表示P＜0.05）

圖3 RANKL 免疫組織化學(xué)染色（比例尺100μm 如圖所示）

圖4 OPG 免疫組織化學(xué)染色（比例尺100μm 如圖所示）

利用上述RANKL、OPG 的陽性表達(dá)面積計算結(jié)果，計算OPG 和RANKL 表達(dá)量的比值。計算結(jié)果顯示:在D7 和D14，OPG/RANKL 表達(dá)量的比值在E+LF 組明顯大于EO 組（圖2D）。

討 論

本研究的前期實驗發(fā)現(xiàn)，LF 灌胃可以在大鼠上頜擴弓及復(fù)發(fā)的過程中促進腭中縫的新骨形成，并且此作用呈一定的計量依賴性，1g/kg 體重的高濃度LF 灌胃可以在此過程中增強腭中縫的骨質(zhì)[3]。本研究便在前期研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用1g/kg 體重LF灌胃，進一步探究LF 在大鼠擴弓和復(fù)發(fā)過程中對腭中縫骨吸收活動的影響及其作用機制。

CTSK 是破骨細(xì)胞特異性表達(dá)與骨質(zhì)溶解密切相關(guān)的重要水解酶[7]，和TRACP 5b、降鈣素受體一同被視作破骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物[8]。CTSK 的表達(dá)量常被用來衡量破骨細(xì)胞的活性[8～10]。CTSK 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明LF 灌胃干預(yù)可能不會影響腭中縫破骨細(xì)胞的組織分布，但可能在一定程度上抑制了上頜擴弓及復(fù)發(fā)過程中腭中縫的破骨活動。這與Hou 等[6]、Walli 等[11]的研究結(jié)果較為一致。然而，Kawazoe 等的大鼠體內(nèi)實驗[12]、Inubushi 等的體外細(xì)胞實驗則得出了相對不同的結(jié)果。這兩個研究表明LF 只能抑制炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的骨吸收過程[13]，而對正畸應(yīng)力刺激導(dǎo)致的破骨活動則沒有作用。聯(lián)系本實驗的研究結(jié)果，可以推測產(chǎn)生這樣研究結(jié)果差異的原因可能是Kawazoe 等的實驗采用的LF 大鼠灌胃濃度為500mg/kg 體重，尚未達(dá)到可以抑制應(yīng)力相關(guān)破骨活動的濃度。

OPG/RANKL/RANK 作用軸是細(xì)胞間調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞破骨活性的重要通路[4]。RANK 分布在破骨前體細(xì)胞的細(xì)胞膜上，通過與成骨細(xì)胞表達(dá)的RANKL結(jié)合從而活化破骨前體細(xì)胞。RANKL 與RANK 的作用受到OPG 的調(diào)節(jié)。OPG 也由成骨細(xì)胞表達(dá)，競爭性與RANK 結(jié)合，阻礙破骨細(xì)胞破骨分化[5]。故OPG 與RANKL 的表達(dá)平衡調(diào)節(jié)著機體的破骨活動以及骨代謝。當(dāng)OPG/RANKL 表達(dá)量的比例升高時，破骨功能受到抑制；而當(dāng)其比例降低時，破骨活動則被促進[14]。一項對去勢大鼠的LF 干預(yù)實驗顯示LF是通過上調(diào)OPG/RANKL 表達(dá)比例來抑制破骨細(xì)胞活性的[6]。在大鼠腭中縫受應(yīng)力牽張以及復(fù)發(fā)改建的過程中，LF 對破骨活動的抑制作用可能與OPG/RANKL/RANK 作用軸有關(guān)。

在本實驗中，OPG 和RANKL 的表達(dá)量在LF 的干預(yù)作用下都有提高，這可能是由LF 導(dǎo)致的成骨樣細(xì)胞的增殖和骨膜下細(xì)胞向腭中縫區(qū)域的聚集引起的。OPG 和RANKL 都是由成骨細(xì)胞表達(dá)的，當(dāng)成骨細(xì)胞的量增加，自然會導(dǎo)致OPG 和RANKL 表達(dá)量的同時增加。然而OPG/RANKL 表達(dá)量的比值在兩個時間點都因為LF 的干預(yù)作用而顯著大于EO組，表明LF 在此過程中促使了OPG/RANKL 表達(dá)比例的上調(diào)。即LF 對破骨活動的抑制作用是通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK 作用軸來實現(xiàn)的。

綜上所述，高濃度LF 灌胃可以在大鼠上頜擴弓及復(fù)發(fā)的過程中抑制腭中縫的破骨活動；對破骨活動的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK 作用軸實現(xiàn)的。