林靜 張晨 董宇杰 劉子臣 李琨 車南穎

淋巴結(jié)是人體重要的免疫器官，主要通過輔助性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞及產(chǎn)生抗體的漿細胞參與對入侵病原體的免疫反應(yīng)[1]。HIV感染后可特異性攻擊人體CD4+T淋巴細胞，造成CD4+T淋巴細胞進行性減少，細胞免疫功能嚴重受損，清除和抵御病原菌感染的能力顯著下降，機會性感染風險明顯增高[1]，成為人體感染HIV后淋巴結(jié)腫大的主要病因之一。常見致病菌為結(jié)核分枝桿菌(MTB)、非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacterium，NTM)和真菌等[2-3]。除臨床實驗室檢查外，組織病理學檢查也是淋巴結(jié)感染性疾病的重要診斷手段，在疾病診斷及鑒別診斷中具有重要臨床價值[4]，但目前臨床關(guān)注及經(jīng)驗均較少。筆者希望通過分析HIV感染/AIDS患者淋巴結(jié)感染性疾病的組織病理學特點、致病病原體形態(tài)學特點和分布部位，進一步提高病理科醫(yī)師對該病的認識。

資料和方法

一、研究材料

搜集2018年1月至2019年6月廣西壯族自治區(qū)龍?zhí)夺t(yī)院收治的153例淺表性淋巴結(jié)腫大的HIV感染/AIDS患者的臨床病理資料。將經(jīng)組織病理學明確診斷為淋巴結(jié)感染性疾病的88例患者作為研究對象，包括男78例(88.6%)，女10例(11.4%)；年齡范圍 26～78歲，中位年齡44(36，54)歲；<60歲者75例(85.2%)，≥60歲者13例(14.8%)；頸部淋巴結(jié)病灶85例(96.6%)，腋窩淋巴結(jié)病灶3例(3.4%)。研究對象組織標本均為手術(shù)切除，總結(jié)分析其蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色特點，并對標本行抗酸染色、過碘酸雪夫(periodic acid-schiff stain, PAS)染色及六胺銀染色查找病原體，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測MTB DNA和熒光PCR熔解曲線法進行分枝桿菌菌種鑒定。

二、研究方法

1.標本處理及特殊染色：將獲得的淋巴結(jié)活檢組織標本經(jīng)4%中性甲醛及時固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4～5 μm。分別經(jīng)抗酸染色、PAS染色、六胺銀染色，光學顯微鏡下觀察組織病理學形態(tài)?？顾崛旧?、PAS染色試劑盒均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，染色方法參照試劑盒說明書進行；六胺銀染色應(yīng)用羅氏全自動免疫組化染色儀。

2.DNA提取：根據(jù)組織大小切取5～10片，石蠟切片厚4 μm，放入1.5 ml離心管中，并根據(jù)試劑盒說明書操作。石蠟包埋組織DNA提取試劑盒購自泰普生物科學(中國)有限公司。

3.MTB DNA檢測：采用熒光定量PCR法檢測MTB特異性序列IS6110，按照試劑盒說明書進行。PCR反應(yīng)體系為40 μl，反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45個循環(huán)；60 ℃熒光檢測。Taqman熒光探針為FAM標記。每批檢測均設(shè)置陰性及陽性對照。MTB DNA測定試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司。熒光定量PCR儀(SLAN-96S)購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

4.分枝桿菌菌種鑒定：根據(jù)不同分枝桿菌ITS片段的特異序列設(shè)計探針，采用熒光PCR探針熔解曲線法特定的熒光通道和熔點(Tm值)進行分枝桿菌菌種的鑒定。操作步驟如下：向PCR反應(yīng)管分別加入陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品DNA，使PCR擴增體系的總體積為25 μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s，57 ℃ 20 s，78 ℃ 20 s，循環(huán)55次；40 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min；40 ℃～90 ℃連續(xù)采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道的熒光信號，升溫速率為0.04 ℃/s。分枝桿菌菌種鑒定試劑盒購自廈門致善生物科技股份有限公司。

三、統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、確診情況

88例研究對象最終確診為MTB感染50例(56.8%)，馬爾尼菲藍狀菌(Talaromycesmarneffei，TM)感染32例(36.4%)，NTM感染3例(3.4%,分別為膿腫分枝桿菌感染1例、蟾蜍分枝桿菌感染1例、胞內(nèi)分枝桿菌感染1例)，MTB并發(fā)TM感染2例(2.3%)，隱球菌感染1例(1.1%)。

二、HE染色的組織病理學表現(xiàn)

88例研究對象HE染色光鏡下觀察組織病理學表現(xiàn)多樣且無特異性，其中，23例可見典型肉芽腫伴壞死(圖1)，存在于MTB、TM、MTB并發(fā)TM、隱球菌感染患者中，且有些感染很難發(fā)現(xiàn)；19例可見不典型肉芽腫伴壞死(圖2)，存在于MTB、TM、MTB并發(fā)TM感染患者中；16例可見組織細胞胞漿內(nèi)粉染的細顆粒狀物(圖3)；而僅見壞死、不典型肉芽腫、典型肉芽腫者分別為9、9、5例(圖4～6)，存在于MTB、TM或NTM感染患者中。1例MTB感染者呈境界模糊的結(jié)節(jié)伴片狀壞死(圖7)；6例TM和1例胞內(nèi)分枝桿菌感染患者均表現(xiàn)為組織細胞浸潤伴少許壞死(圖8)；1例膿腫分枝桿菌感染患者表現(xiàn)為不典型肉芽腫，肉芽腫內(nèi)及周圍均可見廣泛的化膿性感染(圖9)。TM感染患者主要表現(xiàn)為組織細胞浸潤伴或不伴壞死，而不典型肉芽腫伴壞死、化膿性感染少見，與MTB感染患者在以上組織病理學表現(xiàn)方面的差異均有統(tǒng)計學意義，具體見表1。

三、特殊染色組織病理學表現(xiàn)

55例分枝桿菌感染患者(包括50例MTB感染、3例NTM感染、2例MTB并發(fā)TM感染)經(jīng)抗酸染色后，38例(69.1%；37例為MTB感染，1例為胞內(nèi)分枝桿菌感染)可在壞死組織及組織細胞胞漿中找到分枝桿菌(圖10、11)，其中，彎曲的胞內(nèi)分枝桿菌分布于組織細胞胞漿中(圖12)。34例TM感染者(32例單純TM感染，2例MTB并發(fā)TM感染)經(jīng)PAS染色和六胺銀染色均呈陽性(圖13～16)，其中分布在泡沫樣組織細胞胞漿中16例。隱球菌感染也可經(jīng)PAS染色和六胺銀染色呈陽性(圖17、18)，但不易觀察到，較易漏診。

圖1～9 HIV感染/AIDS并發(fā)淋巴結(jié)感染性疾病患者的組織病理學特征表現(xiàn)(HE ×200)。圖1為上皮樣細胞融合形成境界清楚的典型肉芽腫，可見壞死及多核巨細胞。圖2為上皮樣細胞排列比較松散，形成不典型肉芽腫，可見壞死。圖3為胞漿透亮的泡沫樣組織細胞在淋巴結(jié)內(nèi)彌漫浸潤，胞漿內(nèi)可見紅染的細顆粒狀物。圖4為僅見彌漫壞死。圖5為僅見典型肉芽腫。圖6為僅見不典型肉芽腫。圖7為淋巴結(jié)內(nèi)梭形上皮樣細胞增生形成境界模糊的結(jié)節(jié)，可見壞死。圖8為淋巴結(jié)內(nèi)胞漿透亮的組織細胞散在分布。圖9為淋巴結(jié)內(nèi)不典型肉芽腫，中央可見小膿腫形成

表1 各種組織病理學特征在不同淋巴結(jié)感染中的分布情況

圖 10～12 分枝桿菌在抗酸染色下的組織形態(tài)特點和存在部位(油鏡 ×1000)。圖10可見壞死組織中散在少許紅色桿狀、略彎曲并且呈串珠狀的分枝桿菌。圖11可見組織細胞胞漿中散在的分枝桿菌。圖12可見組織細胞胞漿的胞內(nèi)分枝桿菌 圖13～16 馬爾尼菲藍狀菌在PAS染色和六胺銀染色下的組織形態(tài)特點和存在部位。圖13可見泡沫樣組織細胞胞漿中較多的呈圓形或卵圓形或兩端鈍圓的臘腸狀的馬爾尼菲藍狀菌，部分有橫隔(PAS染色 ×400)。圖14可見組織細胞胞漿中較多的馬爾尼菲藍狀菌(六胺銀染色 ×400)。圖15可見上皮樣細胞胞漿中少許馬爾尼菲藍狀菌(六胺銀染色 ×400)。圖16可見壞死組織中少許馬爾尼菲藍狀菌(六胺銀染色 ×400) 圖17～18 隱球菌在PAS染色和六胺銀染色下的組織形態(tài)特點和存在部位。圖17可見壞死組織中少許菌體胞膜紅染，有空暈的隱球菌(PAS染色 ×400)。圖18可見壞死組織中少許菌體胞膜呈黑色的隱球菌(六胺銀染色 ×400)

四、分子病理檢測結(jié)果

MTB DNA陽性者52例，包括50例MTB及2例 MTB并發(fā)TM感染患者，其中確診5例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者為MTB感染患者；菌種鑒定出3例NTM感染患者(分別為膿腫分枝桿菌感染1例、蟾蜍分枝桿菌感染1例、胞內(nèi)分枝桿菌感染1例)；其余均為陰性。

討 論

目前，結(jié)核病仍然是威脅人類健康的重要感染性疾病，也是HIV感染/AIDS患者常見的機會性感染性疾病，約50%的HIV感染/AIDS患者罹患肺外結(jié)核，其中約35%并發(fā)淋巴結(jié)結(jié)核[5]。本研究中，MTB是HIV感染/AIDS并發(fā)淋巴結(jié)感染性疾病患者的主要致病菌，約占56.8%，與以往研究結(jié)果相近[3,6]。

多核巨細胞又稱為朗罕巨細胞，在結(jié)核病灶中較常見，多位于肉芽腫周邊，是肉芽腫微環(huán)境形成時，由單核/巨噬細胞分化的上皮樣細胞融合而成[7]，是具有特征性的病理細胞之一。免疫功能正常的患者感染MTB后，可以在病變組織及器官中形成上皮樣細胞融合而成的典型肉芽腫來抵御致病病原體的擴散；而免疫功能低下的患者感染后，多核巨細胞的數(shù)量會在結(jié)核病灶中明顯減少[8]，缺乏對致病病原體的免疫反應(yīng)，較易形成上皮樣細胞排列松散的不典型肉芽腫[3,9]，與本研究的MTB感染患者中不典型肉芽腫的比例稍高于典型肉芽腫伴壞死的結(jié)果一致。但Wannakrairot等[2]對55例并發(fā)淋巴結(jié)腫大患者進行了研究，結(jié)果顯示病變以典型肉芽腫伴壞死為主，這可能與該研究納入對象的病情較穩(wěn)定有關(guān)。另外，也有研究認為，MTB主要分布于HIV感染/AIDS患者壞死組織中，也可見于組織細胞內(nèi)，但極少見于非壞死性肉芽腫中[10]，與本研究中壞死是僅次于肉芽腫的組織病理學特征一致，筆者認為也與患者免疫功能低下，MTB感染后較難形成肉芽腫包裹，而使MTB廣泛存在于壞死組織中[11]有關(guān)。一般認為，抗酸染色是分枝桿菌病理診斷的傳統(tǒng)特殊染色方法，但其陽性率較低，僅為27.1%[12]，明顯低于本研究中高達69.1%的陽性率，可能與研究對象免疫力低，MTB荷載量較高[3]有關(guān)。

相較于淋巴結(jié)結(jié)核，NTM淋巴結(jié)病往往表現(xiàn)為不典型肉芽腫伴匍匐性壞死、壞死中散在核碎裂和炎性細胞浸潤、不典型肉芽腫、無壞死等，但都不具有特異性[13-14]。然而，某些NTM感染也可能形成相對特征性的組織病理學形態(tài)，如膿腫分枝桿菌感染為化膿性炎，且肉芽腫中心可形成小膿腫；而胞內(nèi)分枝桿菌可較MTB菌體更長且呈菌團樣分布[3]，或更粗短[15]。另外，MTB和NTM感染均可形成分枝桿菌性梭形細胞假瘤(mycobacterial spindle cell pseudotumour，MSP)，該梭形細胞假瘤是由上皮樣細胞呈梭形細胞樣增生而形成，是不典型肉芽腫，其免疫組化抗體CD68標記梭形的上皮樣細胞呈陽性，是很好的鑒別診斷標記物。本研究中1例 MTB感染患者的病變淋巴結(jié)病理表現(xiàn)為溫和的梭形細胞增生，并形成境界模糊的結(jié)節(jié)，類似MSP樣改變[16]，但梭形細胞內(nèi)可找到分枝桿菌[17]，需注意與淋巴結(jié)梭形細胞瘤進行鑒別。相對于淋巴結(jié)結(jié)核，NTM淋巴結(jié)病的發(fā)生率較低，本研究中僅3例感染患者，但由于其與MTB都可以存在于組織細胞胞漿中，且量少、形態(tài)相似，抗酸染色極難辨別，可通過分子病理技術(shù)進行分枝桿菌菌種鑒定，明顯提高診斷陽性率[4,15]。

TM是一種致病力較強的溫度依賴性雙相型真菌，主要流行于我國的南方地區(qū)和東南亞各國，常見于HIV感染/AIDS患者[18-19]，是本組患者TM感染占比高達36.4%的原因。淋巴結(jié)TM感染導致的組織病理學形態(tài)因患者免疫力的不同，可表現(xiàn)為肉芽腫型、化膿型及壞死型。當TM感染免疫功能低下患者后，可以在巨噬細胞內(nèi)逃逸殺傷，繼續(xù)繁殖[20]，使其主要分布于組織細胞胞漿中，以組織細胞浸潤常見；而較少分布于上皮樣細胞及壞死組織中，故少見肉芽腫和化膿性感染，與本研究32例TM感染患者中16例表現(xiàn)為組織細胞浸潤的結(jié)果一致。PAS染色和六胺銀染色可很好地找到TM，本研究34例TM感染患者均經(jīng)PAS染色和六胺銀染色確診。另外，TM大小不一，呈兩端鈍圓的卵圓形及臘腸狀孢子，中部可見橫隔，表現(xiàn)為裂殖，與組織胞漿菌形態(tài)相似(菌體稍小，大小較一致，卵圓形，一端或兩端變細，呈現(xiàn)出芽生殖，可見分枝狀與母體相連處變細的芽孢)，臨床中應(yīng)注意與之鑒別。

隱球菌感染也好發(fā)于免疫功能低下者，主要引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肺部感染，而淋巴結(jié)感染較少見，一般為全身播散性病變累及淋巴結(jié)[21]。隱球菌主要分布在多核巨細胞或巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)，也可以分布在纖維間質(zhì)中，表現(xiàn)為圓形或橢圓形，莢膜較厚，中間有空暈，與周圍組織間有透亮間隙。當免疫功能正?；颊吒腥倦[球菌時，主要形成由多核巨細胞和上皮樣細胞構(gòu)成的肉芽腫性炎，且伴淋巴細胞浸潤和纖維組織增生，構(gòu)成界限較清晰的結(jié)節(jié)；而在免疫功能低下患者中，典型肉芽腫少見，炎性滲出、壞死等病變多見，易被漏診或忽視[22-24]。本研究中僅1例隱球菌感染患者，其典型肉芽腫伴壞死的組織病理表現(xiàn)與MTB感染相似，但含菌量較少，HE染色難以識別，較易通過PAS和六胺銀染色在壞死組織中識別。

此外，本研究中6例患者的淋巴結(jié)表現(xiàn)為反應(yīng)性增生，經(jīng)特殊染色和分子病理檢測證實5例為MTB感染、1例為TM感染。可能是淋巴結(jié)病變處于感染早期，還未形成典型的相關(guān)病變，僅有單核細胞及淋巴細胞增生，且早期致病病原體含量較少，較易被忽視。本研究中有2例患者同時并發(fā)MTB和TM感染，說明此類患者可同時并發(fā)多種致病菌感染[22-23]，建議在病理診斷時仔細觀察，必要時采用分子病理技術(shù)協(xié)助診斷，避免漏診。

綜上所述，本組患者主要致病病原體為MTB，組織病理學表現(xiàn)以肉芽腫為主；其次為TM感染，以組織細胞浸潤為主。但不同致病病原體組織病理學表現(xiàn)多樣且不具有特異性，特殊染色和分子病理檢測技術(shù)可明顯提高診斷率，減少漏診和誤診。