談小文 王媛 崔曉利 黨麗云 雷靜 任斐 趙國(guó)連

分子生物學(xué)檢測(cè)方法因其具有檢測(cè)敏感度高、特異性強(qiáng)和時(shí)效性高等特點(diǎn)，成為結(jié)核病快速診斷的重要檢測(cè)手段。對(duì)于分子生物學(xué)檢測(cè)，尋找檢測(cè)效率高且存在特異性的靶基因尤為重要，分子檢測(cè)靶基因的種屬特異性和多拷貝序列是確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和高效性的重要因素。結(jié)核病分子生物學(xué)病原診斷常用的診斷靶標(biāo)有IS6110、16SrRNA、gryB和rpoB基因等，以上基因均屬于管家基因。其中IS6110為多拷貝基因，其用于病原學(xué)診斷敏感度高于單拷貝基因，但是IS6110基因并非存在于所有結(jié)核分枝桿菌中，有的菌株IS6110基因缺失，可能造成假陰性結(jié)果[1]。本研究對(duì)西安市胸科醫(yī)院收治的1例IS6110基因零拷貝菌株感染的結(jié)核病患者病原學(xué)診斷過(guò)程及分離株測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，旨在為臨床診斷工作提供借鑒。

臨床資料

患者，男，50歲。因間斷咳嗽、咳痰、胸悶、氣促10個(gè)月，伴發(fā)熱1周，于2020年6月13日入住西安市胸科醫(yī)院。患者5年前無(wú)明顯誘因出現(xiàn)咳嗽、咳白色黏痰，未行特殊處理。2019年8月27日患者因胸悶、氣促，就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院，診斷為“塵肺”，給予對(duì)癥治療后癥狀稍有好轉(zhuǎn)，但活動(dòng)后仍感到氣促，休息后可緩解，隨著病程進(jìn)展，氣促癥狀逐漸加重?；颊哂?020年6月5日出現(xiàn)發(fā)熱，最高體溫37.9°，午后明顯，無(wú)畏寒、寒顫，就診于山陽(yáng)縣中醫(yī)醫(yī)院，行胸部CT示雙肺出現(xiàn)病灶并形成空洞，不排除肺結(jié)核可能，遂來(lái)我院做進(jìn)一步診斷治療?；疾∑陂g，患者無(wú)咯血，無(wú)胸痛和心慌，無(wú)惡心和嘔吐，體質(zhì)量6個(gè)月減輕10 kg。

入院時(shí)體格檢查：體溫37 ℃，脈搏92次/min，呼吸頻率24次/min，血壓140/100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。患者神志清楚，呼吸平穩(wěn)，口齒清晰，全身皮膚黏膜無(wú)黃染，全身淺表淋巴結(jié)無(wú)腫大；胸廓正常，無(wú)肋間隙增寬；雙肺叩診清音，呼吸音粗，聞及干性啰音；心率92次/min，節(jié)律齊，無(wú)雜音；腹部柔軟，無(wú)壓痛、反跳痛；肝脾肋下未捫及；四肢活動(dòng)正常，雙下肢未見浮腫。

實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞(WBC)5.53×109/L[正常范圍：(3.50～9.50)×109/L]，血紅蛋白(Hb)8 g/L(正常范圍：130～175 g/L)，血紅細(xì)胞沉降率(ESR)25 mm/1 h(正常范圍：0～15 mm/1 h)，C反應(yīng)蛋白(CRP)130.94 mg/L(正常范圍：0～6.00 mg/L)；抗鏈球菌溶素O(ASO)、類風(fēng)濕因子(RF)、免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)均陰性，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)陽(yáng)性；降鈣素原1.05 μg/L(正常范圍：0～0.50 μg/L)；結(jié)核抗體五項(xiàng)：38 kDa抗體陽(yáng)性，培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)抗體陽(yáng)性，其余為陰性。痰標(biāo)本涂片分枝桿菌抗酸染色陽(yáng)性(++++)。痰標(biāo)本分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)(雙通道PCR-熒光探針法)結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌核酸陽(yáng)性。結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)(RNA恒溫?cái)U(kuò)增)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性。為進(jìn)一步驗(yàn)證雙通道PCR-熒光探針法的假陰性及RNA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)假陽(yáng)性的可能，用同一份標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)(恒溫?cái)U(kuò)增熒光法)，結(jié)果為陰性；GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)(巢式探針-熒光定量PCR法)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，利福平野生型。同時(shí)對(duì)患者入院標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，1周后痰培養(yǎng)分枝桿菌陽(yáng)性，MPB 64單克隆抗體檢測(cè)陽(yáng)性。痰標(biāo)本直接提取的核酸樣本及培養(yǎng)后細(xì)菌提取的核酸樣本同時(shí)做分枝桿菌菌種基因鑒定(DNA微陣列芯片法)結(jié)果均為結(jié)核分枝桿菌。為進(jìn)一步明確分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果不一致的原因，通過(guò)痰標(biāo)本直接提取核酸及培養(yǎng)后細(xì)菌提取核酸進(jìn)行IS6110基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，該例患者感染的結(jié)核分枝桿菌為IS6110基因零拷貝菌株。對(duì)培養(yǎng)后的菌株進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性(微孔板法)試驗(yàn)顯示除異煙肼和帕司煙肼耐藥外，其余藥品均敏感。

圖1～4 患者，男，50歲。胸部CT掃描(2020-07-06)顯示，雙肺彌漫分布粟粒狀、斑片狀及條索樣密度增高影，邊界欠清晰，密度不均勻，雙肺上葉近肺門處病灶實(shí)變，以右肺為著，局部伴空洞形成，右肺上葉部分支氣管變窄；雙肺門可見增大的淋巴結(jié)，伴鈣化；雙側(cè)胸膜增厚、粘連

影像學(xué)檢查：患者入院前查胸部CT(山陽(yáng)縣中醫(yī)醫(yī)院，2020-06-11)：胸廓對(duì)稱無(wú)畸形，雙側(cè)肺野透光度降低，支氣管血管束增重、紊亂，雙肺彌漫性粟粒狀、斑片狀及條索狀密度稍高影，雙肺上葉后段可見較大不規(guī)則厚壁空洞，邊緣毛糙，壁內(nèi)凹凸不平，不光整，心影形態(tài)大小未見異常。入院后在我院查胸部CT(2020-07-06)：雙肺多葉多段有散在分布微小結(jié)節(jié)密度增高影并空洞形成；塵肺；雙側(cè)胸腔積液及胸膜增厚粘連(圖1～4)。

治療情況：患者住院初期分子診斷已明確為結(jié)核分枝桿菌感染，而培養(yǎng)結(jié)果未出，無(wú)法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，且患者病情復(fù)雜，病灶較重，遂給予左氧氟沙星加強(qiáng)抗結(jié)核治療，聯(lián)合H-R-Z-E(H：異煙肼；R：利福平；Z：吡嗪酰胺；E：乙胺丁醇)方案行抗結(jié)核治療，并常規(guī)輔以預(yù)防性保肝治療。入院15 d后分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，微孔板藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果提示患者對(duì)異煙肼和帕司煙肼耐藥，胸部CT檢查(2020-07-06)結(jié)果顯示治療效果不理想。經(jīng)過(guò)評(píng)估，對(duì)該例患者治療方案進(jìn)行修正，繼續(xù)給予左氧氟沙星加強(qiáng)抗結(jié)核治療，聯(lián)合R-Z-E-Am(Am：阿米卡星)方案行抗結(jié)核治療，并轉(zhuǎn)至耐藥科繼續(xù)治療，患者訴因家庭原因堅(jiān)持出院，于2020年7月8日辦理出院。

討 論

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群是引起肺結(jié)核的主要病原體，IS6110是結(jié)核分枝桿菌基因組中的一段多拷貝保守序列，含有1361 bp核苷酸和28 bp的反向末端的重復(fù)序列，只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中[2]。對(duì)于我國(guó)廣泛流行的北京基因型結(jié)核分枝桿菌[3]，根據(jù)菌株基因組核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factors，NTF)區(qū)域中是否存在結(jié)核分枝桿菌特異性插入序列(insertion sequence，IS)6110，可分為北京基因型古代株和北京基因型現(xiàn)代株2個(gè)亞型[4]。北京基因型古代株的NTF區(qū)中沒有IS6110，而北京基因型現(xiàn)代株 NTF 區(qū)中至少含有1個(gè)IS6110。

近年來(lái)，基于針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特定序列的IS6110、hsp65、16S rRNA、rpoBRRDR區(qū)域、85B抗原、38 kDa抗原的某些序列的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，已經(jīng)開發(fā)了許多結(jié)核病分子診斷方法。雖然大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌分離株中IS6110基因?yàn)楦呖截惢?，但謝彤等[5]報(bào)道天津地區(qū)517例臨床分離株中70株為IS6110基因缺陷株，其檢出率高達(dá)13.5%，所以臨床應(yīng)用中要警惕單拷貝或零拷貝分離株對(duì)以IS6110為靶點(diǎn)的分子檢測(cè)可能造成假陰性結(jié)果的可能。IS6110在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中具有特異性、穩(wěn)定性及高拷貝性，相比于單拷貝的其他序列如 MPB64、MTP40等具有更高的敏感度和特異度，因此IS6110是目前臨床分子生物學(xué)結(jié)核分枝桿菌診斷最常用的擴(kuò)增靶點(diǎn)[6]。

但是IS6110低拷貝甚至零拷貝的結(jié)核分枝桿菌將會(huì)對(duì)以IS6110為檢測(cè)靶點(diǎn)的檢測(cè)方法的陽(yáng)性率及準(zhǔn)確性造成一定影響。我國(guó)已有文獻(xiàn)報(bào)道IS6110缺失菌株(北京基因古代株)在中國(guó)不同地區(qū)的流行率為13.5%～23.57%[5, 7]。裴秀英等[8]對(duì)16株分離自上海的結(jié)核分枝桿菌菌株應(yīng)用RFLP技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)1株IS6110零拷貝株和1株IS6110單拷貝株。然而，目前對(duì)于中國(guó)大部分地區(qū)IS6110拷貝數(shù)分布的研究還不足，低拷貝或零拷貝菌株對(duì)臨床診斷的影響還需要進(jìn)一步探究。

本例患者入院初期應(yīng)用以IS6110和hsp65為靶基因的分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)方法(雙通道PCR-熒光探針法)，結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，而以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群16S rRNA 序列特異性片段為靶標(biāo)的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)方法(RNA恒溫?cái)U(kuò)增)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌，出現(xiàn)兩種分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果不一致的情況。為進(jìn)一步驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，筆者又應(yīng)用以IS6110為單靶基因的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)方法(恒溫?cái)U(kuò)增熒光法)，結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陰性，而以rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區(qū)域(RRDR)為靶基因的GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)(巢式探針-熒光定量PCR法)，結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌，利福平敏感?；?種不同的分子生物學(xué)檢測(cè)試劑得到的檢測(cè)結(jié)果存在差異，通過(guò)分析各種檢測(cè)試劑的檢測(cè)原理及檢測(cè)靶點(diǎn)，懷疑為IS6110基因缺失菌株，最后通過(guò)測(cè)序技術(shù)鑒定該例患者感染菌株為IS6110基因缺失。

本例患者出現(xiàn)兩種分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果不一致的情況，對(duì)針對(duì)IS6110單靶點(diǎn)的PCR方法在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方面的可靠性會(huì)造成影響，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，而低拷貝菌株因其多態(tài)性有限，也同樣會(huì)影響其在基因分型中的鑒定能力。因此，在結(jié)核病診斷方面需聯(lián)合其他的基因靶點(diǎn)，如MPB64、MTP40、16S rRNA、hsp65等組成多重PCR法提高臨床標(biāo)本中分枝桿菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

除了選擇合適的靶基因，不同原理的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)陽(yáng)性率也有一定的差異。本例患者應(yīng)用4種方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行核酸檢測(cè)，在實(shí)際應(yīng)用中都有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的情況，無(wú)法對(duì)原始標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(digital polymerase chain reaction，dPCR)是一項(xiàng)基于單分子目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增的絕對(duì)定量技術(shù)，比標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)具有更高的敏感度和準(zhǔn)確性，且dPCR具有無(wú)需循環(huán)CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)樣品中DNA分子絕對(duì)定量的優(yōu)點(diǎn)[9]，未來(lái)可能對(duì)于低濃度和低拷貝的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)具有廣泛的應(yīng)用前景，但還需進(jìn)行更多的研究加以證實(shí)。

綜上，基于目前結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢測(cè)診斷試劑的廣泛應(yīng)用，要警惕單拷貝或者零拷貝分離株對(duì)以IS6110為靶點(diǎn)的分子檢測(cè)可能造成假陰性結(jié)果的可能。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員需要對(duì)不同檢測(cè)試劑的檢測(cè)原理進(jìn)行熟練掌握，當(dāng)不同試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)不一致時(shí)，要積極協(xié)助臨床進(jìn)行分析，以免出現(xiàn)錯(cuò)誤判斷，延誤患者的診斷與治療。