柯 悅，李宇星，師小博，郭 偉，劉笑笑，王玉琛，阮琴利，潘紀(jì)元，楊曉平

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院：1. 腫瘤放療科；2. 胸外科，陜西西安 710004)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率分別位列全球惡性腫瘤的第7位和第6位。食管癌發(fā)病率具有明顯的地理分布差異，且兩種主要病理類型——鱗狀細(xì)胞癌和腺癌的病因完全不同。在許多低收入國家，如亞洲和撒哈拉以南的非洲地區(qū)，鱗狀細(xì)胞癌占食管癌總數(shù)的90%以上[1]。漸進(jìn)性吞咽困難是食管癌最主要的臨床表現(xiàn)，由于缺乏特異的癥狀和體征，許多患者在確診時已處于中晚期。對于不可手術(shù)切除的局部晚期食管癌，根治性同步放化療是其標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。盡管如此，食管癌的5年總生存率為15%～25%[2]。因此，在傳統(tǒng)放化療的基礎(chǔ)上，尋找更有效的抗腫瘤藥物和潛在的分子靶點在食管癌未來的治療中十分關(guān)鍵。

RYBP(RING1 and YY1-binding protein)是多梳蛋白(Polycomb Group, PcG)家族成員之一，是一類在染色質(zhì)水平抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，在促進(jìn)凋亡、個體發(fā)育、細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生發(fā)展及調(diào)節(jié)免疫等過程中發(fā)揮重要作用[3]。RYBP能與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(fas-associated protein with death domain, FADD)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)8，Caspase-10相互作用促進(jìn)細(xì)胞死亡[4]，并與人類3型纖維連接蛋白和1型錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白(fibronectin type3 and ankyrin repeat domains protein1, FANK1)和凋亡素基因(apoptin)相互作用從而特異性誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)凋亡[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，RYBP能通過下調(diào)G1-S期相關(guān)基因表達(dá)水平，從而抑制食管鱗癌增殖能力[7]。此外，對原發(fā)性肝癌、非小細(xì)胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，RYBP能通過調(diào)節(jié)BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)，多聚ADP核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1]，Caspase 8等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增加化療藥物的敏感性[8-9]。

YM155是存活素(survivin)的一種小分子轉(zhuǎn)錄抑制劑。在多種惡性腫瘤，如成人T細(xì)胞白血病、卵巢癌、腎癌中，YM155單用或聯(lián)合使用能抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)凋亡，增加抵抗細(xì)胞的敏感性，并延長荷瘤裸鼠的生存[10-12]。研究顯示，YM155能通過激活PARP-1，進(jìn)而催化合成多聚ADP核糖[Poly-(ADP)ribose, PAR]，線粒體通透性改變，以及早期凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)核漿轉(zhuǎn)位導(dǎo)致Parthanatos，從而抑制食管鱗癌細(xì)胞及荷瘤裸鼠移植瘤生長[13]。Parthanatos是一種依賴于PARP-1激活導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，由Harraz命名(Thanatos：希臘神話中的死亡之神)，是一種新的細(xì)胞死亡形式，主要發(fā)生在中風(fēng)、心力衰竭、糖尿病、帕金森病及缺血再灌注等疾病[14-15]。既往研究顯示，RYBP過表達(dá)在原發(fā)性肝癌、肺癌中可致PARP-1激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-9]。而在食管癌中，RYBP過表達(dá)能否激活PARP-1，能否導(dǎo)致細(xì)胞通過Parthanatos途徑死亡從而增加食管鱗癌對YM155的敏感性是本研究探索的關(guān)鍵問題。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞系KYSE170是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院趙曉航教授課題組提供。細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基，放置在37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及過表達(dá)細(xì)胞系建立①將KYSE170細(xì)胞種在6孔板上，培養(yǎng)至90%左右；②根據(jù)RYBP及pCMV6質(zhì)粒(Origene，美國)濃度分別計算出所需加入質(zhì)粒體積(1 μg)；③配制轉(zhuǎn)染試劑：取10個1.5 mL管，分別加入150 μL Opi MEM，每2個管為一組，分別加入等體積的lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)及質(zhì)粒標(biāo)記為A、B，常溫下放置5 min；④將每組中的A、B管混合，室溫放置40 min。用PBS清洗培養(yǎng)基2遍后，每孔加入700 μL Opti MEM，將混合溶液分別加入培養(yǎng)基中；⑤6 h后，加入200 mL/L FBS的1640完全培養(yǎng)基。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；⑥轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞消化傳代至10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，使用含800 mg/mL的G418培養(yǎng)基進(jìn)行篩選至少2周，直至形成單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，至細(xì)胞長滿保種并進(jìn)行后續(xù)鑒定。

1.3 蛋白提取及Western blotting檢測蛋白表達(dá)①細(xì)胞全蛋白采用RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解細(xì)胞；細(xì)胞核蛋白、包漿蛋白及線粒體蛋白提取采用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組提取試劑盒(Calbiochem，德國)提取；②上述蛋白提取液用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(赫特，中國)定量；③使用SDS-PAGE凝膠配置試劑盒配置8%～12%分離膠和4%濃縮膠，將30 μg蛋白質(zhì)上樣進(jìn)行凝膠電泳；④采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，110 V恒壓轉(zhuǎn)70 min；⑤采用80 mL/L脫脂牛奶室溫下封閉3 h后孵育相應(yīng)一抗：anti-RYBP(1∶1 000，Abcam，美國)，anti-PARP-1(1∶1 000，Cell Signaling Technology，美國)，anti-AIF(1∶500，Santa Cruz Biotechnology，美國)，anti-PAR(Merck Millipore，美國)，anti-β-actin(1∶3 000，Sigma-Aldrich，美國)，anti-Lamin B(1∶500，Santa Cruz Biotechnology，美國)，anti-GAPDH(1∶500，Santa Cruz Biotechnology，美國)；⑥洗膜后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1 h并再次洗膜；⑦顯色。

1.4 CCK-8法檢測YM155對細(xì)胞抑制率將分別轉(zhuǎn)染RYBP質(zhì)粒和對照空載質(zhì)粒后的細(xì)胞以10 000個/孔的密度接種于96孔板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后加入YM155，設(shè)置不同濃度梯度(2.216 5×10-3、4.432 9×10-3、8.865 8×10-3、17.731 6×10-3、35.463 2×10-3μg/mL)。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h，在終止實驗前2 h每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃，50 mL/L CO2避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的光密度值(D)。以上實驗均重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡將已轉(zhuǎn)染后的KYSE170細(xì)胞，加入8.865 8×10-3μg/mL YM155分別處理24、48 h，分別收集上清中和貼壁細(xì)胞，離心并使用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞備好樣品，后使用細(xì)胞凋亡試劑盒(B&D，美國)說明書操作，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。該實驗重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光實驗①將已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)至70%～90%時以5×105個/孔于6孔板內(nèi)進(jìn)行爬片，待細(xì)胞貼壁后，加入8.865 8×10-3μg/mL YM155處理12 h后更換為正常培養(yǎng)基，用室溫的2 mL PBS清洗2次。②40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗甲醛3次。③0.1% Triton X-100 2 mL室溫覆蓋爬片10 min后，用1×PBS洗滌。④20 mL/L BSA溶液封閉30 min，1×PBS洗滌。⑤100 μL一抗于濕盒內(nèi)，4 ℃靜置孵育過夜。⑥用PBS洗3次后加入稀釋好的熒光標(biāo)記二抗，將玻片置于濕盒內(nèi)，避光，室溫孵育30 min。⑦PBS漂洗3次后使用DAPI封片，熒光顯微鏡下照相(熒光顯微鏡，Nikon ECLIPSE 80i C-SHG1，日本)。

2 結(jié) 果

2.1 過表達(dá)RYBP對YM155敏感性的影響分別用2.216 5×10-3、4.432 9×10-3、8.865 8×10-3、17.731 6×10-3、35.463 2×10-3μg/mL的YM155處理KYSE170-RYBP及KYSE170-Ctrl細(xì)胞24、48 h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，計算IC50并繪制藥物劑量-抑制率柱狀圖。結(jié)果顯示，YM155處理24 h后，KYSE170-RYBP組和KYSE170-Ctrl的IC50分別為2.749 7×10-3μg/mL、17.810 5×10-3μg/mL；YM155處理48 h后，兩組的IC50分別為2.206 3×10-3μg/mL、17.759 1×10-3μg/mL(圖1，表1)。提示RYBP過表達(dá)能顯著增加YM155對食管鱗癌細(xì)胞KYSE170的抑制率。

圖1 不同濃度YM155分別處理24 h(A)，48 h(B)后KYSE170-Ctrl及KYSE170-RYBP細(xì)胞的抑制率Fig.1 The inhibition ratio of KYSE170-Ctrl and KYSE170-RYBP cells after indicated concentration of YM155 treatment for 24 (A) and 48 (B) hours*P<0.01, **P<0.001。

表1 YM155分別處理24及48 h KYSE170-Ctrl及KYSE170-RYBP細(xì)胞的IC50值Tab.1 IC50 of KYSE170-Ctrl and KYSE170-RYBP after YM155 treatment for 24 and 48 hours

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞死亡形式采用8.865 8×10-3μg/mL YM155分別處理KYSE170-Ctrl及KYSE170-RYBP 24、48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞死亡形式及百分比，結(jié)果顯示，KYSE170-RYBP組較KYSE170-Ctrl組的細(xì)胞死亡比例明顯增加，且存在凋亡及壞死兩種死亡形式(圖2)。

圖2 YM155處理后檢測細(xì)胞死亡形式及百分比Fig.2 Cell death pattern and percentage after YM155 treatment*P<0.01。

2.3 過表達(dá)RYBP后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的變化在食管鱗癌細(xì)胞KYSE170中外源性過表達(dá)RYBP，Western blotting檢測PARP1的表達(dá)水平明顯升高，而p53、Caspase8表達(dá)未見明顯增加(圖3A)。使用8.865 8×10-3μg/mL YM155分別處理12、24 h后，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果顯示，PARP-1的表達(dá)水平隨藥物作用時間明顯增加并出現(xiàn)活化切割條帶，KYSE170-RYBP組表達(dá)量及活化程度高于對照組；Caspase8的表達(dá)量在YM155作用24 h時出現(xiàn)活化，但未見明顯Caspase3的活化(圖3B)。

圖3 過表達(dá)RYBP后(A)，8.865 8×10-3μg/mL YM155處理24 h后(B)免疫印跡法檢測細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化Fig.3 Expression of cell death related protein after RYBP overexpression (A), and 8.865 8×10-3μg/mL YM155 treatment for 24 hours (B)

2.4 YM155處理后細(xì)胞組分蛋白質(zhì)水平的變化經(jīng)YM155處理后，分別提取線粒體及細(xì)胞核蛋白，Lamin B作為細(xì)胞核內(nèi)參，GAPDH作為線粒體蛋白內(nèi)參。結(jié)果顯示，經(jīng)YM155處理后，AIF由線粒體進(jìn)入細(xì)胞核，PAR在細(xì)胞核內(nèi)積累，且在RYBP過表達(dá)組上述變化更為顯著(圖4)。

圖4 YM155處理后細(xì)胞組分蛋白中AIF(A，B)，PAR(C，D)的表達(dá)水平變化Fig.4 Expressions of AIF (A, B) and PAR (C, D) in cytosolic fraction protein after YM155 treatment

2.5 YM155處理后免疫熒光檢測PAR及AIF表達(dá)為進(jìn)一步驗證YM155處理后細(xì)胞內(nèi)AIF及PAR的改變，選擇KYSE170-RYBP細(xì)胞，并經(jīng)YM155處理12 h后進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果顯示，較未加藥組，YM155處理使PAR于細(xì)胞核內(nèi)聚積，AIF則部分由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核(圖5)。

圖5 YM155處理后免疫熒光檢測AIF(A)，PAR(B)表達(dá)Fig.5 Translocation of AIF (A) and accumulation of PAR (B) in KYSE170-RYBP cell lines after YM155 treatment

3 討 論

放化療是不可手術(shù)的局部進(jìn)展期食管癌的主要治療手段，傳統(tǒng)的化療藥物包括鉑類、氟尿嘧啶及紫杉醇類，由于毒性及耐藥性導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制，使食管癌的整體預(yù)后仍較差。新型小分子抑制劑YM155在多種惡性腫瘤中顯示出良好的抗腫瘤作用，目前已有多項相關(guān)的Ⅱ期臨床試驗正在開展。RYBP是一種在染色質(zhì)水平通過表觀遺傳修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育過程發(fā)揮重要功能。近年來多項研究顯示，RYBP在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著抗腫瘤效應(yīng)。本課題組前期通過構(gòu)建外源性過表達(dá)RYBP的食管鱗癌細(xì)胞系，證實RYBP能通過抑制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換從而抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖能力[7]。

本研究在前期研究構(gòu)建的RYBP過表達(dá)食管鱗癌細(xì)胞系及其對照組細(xì)胞中檢測凋亡相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RYBP后能明顯增加PARP-1表達(dá)，但Caspase8及p53表達(dá)未見明顯增加。進(jìn)一步通過YM155處理細(xì)胞后，經(jīng)CCK8及流式分析檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RYBP組細(xì)胞對YM155的敏感性高于對照組，且細(xì)胞死亡形式包含凋亡及壞死兩種形式。為進(jìn)一步明確細(xì)胞的死亡途徑，使用YM155處理細(xì)胞后經(jīng)分別提取線粒體及細(xì)胞核蛋白，免疫印跡法顯示細(xì)胞核中PAR積累增多，AIF由線粒體進(jìn)入細(xì)胞核，且RYBP過表達(dá)組的上述效應(yīng)更為顯著。免疫熒光結(jié)果也證實這一假設(shè)。提示YM155處理后細(xì)胞經(jīng)Parthanatos途徑死亡，而RYBP可能是其死亡途徑中一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白。

在正常生理條件下，當(dāng)DNA受到損傷時，PARP-1通過識別有缺口的DNA，與之結(jié)合并激活，催化底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)轉(zhuǎn)化成為ADP核糖基化蛋白受體，后者與核受體蛋白結(jié)合形成多聚ADP核糖鏈，達(dá)到一定長度后降解產(chǎn)生聚ADP核糖，介導(dǎo)堿基切除修復(fù)復(fù)合物[(X射線交錯互補(bǔ)修復(fù)基因(X-ray repair cross complementing group 1, XRCC1)為腳手架，與聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ結(jié)合形成的復(fù)合物]參與DNA單鏈斷裂處的修復(fù)[16]。而在病理條件下，如中風(fēng)、缺血再灌注損傷或藥物作用下，PARP-1大量激活，并觸發(fā)Parthanatos。既往研究顯示，YM155能通過激活PARP-1誘導(dǎo)食管癌發(fā)生Parthanatos[13]。本研究及多項研究均發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤中，RYBP過表達(dá)后能明顯增加PARP-1的表達(dá)水平，但在本研究發(fā)現(xiàn)未能激活Caspase家族，而RYBP是通過何種方式激活PARP-1，并在YM155的作用下增加食管鱗癌的Parthanatos，仍需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

RYBP能通過激活PARP-1/AIF/PAR增加食管鱗癌細(xì)胞對YM155的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生Parthanatos。