張艷慧，丁 玉，李淑榮

（1.黃河科技學(xué)院，河南鄭州 450005；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000）

熊果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，主要存在于枇杷葉、熊果果實(shí)、女貞葉、毛泡桐葉等植物部位中［1］，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗氧化、調(diào)血脂、抗腫瘤、保肝、抗粥樣動(dòng)脈硬化等多種藥理作用［2-5］，對(duì)人卵巢癌耐順鉑SKOV3／DDP 細(xì)胞裸鼠移植瘤具有較好的抑制活性［6］，其機(jī)制可能與抑制抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)有關(guān)，故備受科研工作者的關(guān)注［7-8］。但熊果酸溶解性較差［9］，口服生物利用度較低，限制了其藥效的充分發(fā)揮及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

磷脂復(fù)合物是藥物和磷脂在一定條件下通過(guò)氫鍵、范德華力等形式結(jié)合而成一種復(fù)合物［10-11］，可改善藥物溶解性能，并促進(jìn)其吸收，提高其生物利用度，但它易受胃腸道酶解、pH 等因素的影響，使得生物利用度提高程度有限［12］。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體是在固體脂質(zhì)納米?；A(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新劑型，具有穩(wěn)定性好、載藥量高等優(yōu)勢(shì)，將磷脂復(fù)合物包裹于其中時(shí)可對(duì)前者提供保護(hù)作用，從而增加其穩(wěn)定性。因此，本實(shí)驗(yàn)制備熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260／6310 型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；AB265-S／FACT 型電子天平［梅特勒托利多儀器（上海）有限公司］；85-2 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；SHZ-82 型空氣恒溫臺(tái)式振蕩器（常州金壇良友儀器有限公司）；JC-S12／S24 型水浴氮吹儀（青島聚創(chuàng)世紀(jì)環(huán)?？萍加邢薰荆?；XW-80A 型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 熊果酸原料藥（批號(hào)PT20171019，西安飛達(dá)生物科技有限公司）；熊果酸對(duì)照品（批號(hào)YY20160525，純度99.2%，上海源葉生物科技有限公司）；甘草次酸對(duì)照品（批號(hào)110123-201608，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；大豆卵磷脂（批號(hào)PC-98T，上海輔必成醫(yī)藥科技公司）；單硬脂酸甘油酯（Kolliwax GMS，德國(guó)巴斯夫公司）。四氫呋喃為色譜純（德國(guó)Merck 公司）。

1.3 動(dòng)物 SD 大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雌雄兼具，體質(zhì)量（300±20）g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 熊果酸含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1 mol／L磷酸（85 ∶ 15）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 方法學(xué)考察 精密稱取熊果酸對(duì)照品20.0 mg，溶于50.0 mL 乙腈中，即得400.0 μg／mL母液，精密量取適量，流動(dòng)相依次稀釋至200.0、100.0、50.0、25.0，10.0、2.0 μg／mL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）對(duì)熊果酸質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，得方程為Y ＝0.039 6X -0.007 4（r ＝0.999 8），在2.0～200.0 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取200.0、50.0、2.0 μg／mL 對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得日內(nèi)精密度RSD 分別為0.09%、0.13%、0.17%；各連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 d，每天1 次，測(cè)得日間精密度RSD 分別為0.31%、0.24%、0.69%，表明該方法精密度良好。取熊果酸對(duì)照品10 mg，溶于100 mL乙腈中，超聲溶解，即得供試品溶液，于0、2、4、6、12、24、48 h 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得其峰面積RSD 為0.58%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液，分別制備含10.0、25.0、50.0 μg／mL 熊果酸的樣品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得平均加樣回收率分別為100.57%、99.12%、99.34%，RSD 均小于 1.12%。取2.0 μg／mL對(duì)照品溶液，將“2.1.1”項(xiàng)下流動(dòng)相逐步稀釋，測(cè)得定量限（S／N＝10）為5.0 ng／mL，檢測(cè)限（S／N＝3）為2.0 ng／mL。

2.2 熊果酸磷脂復(fù)合物制備及其復(fù)合率、溶解度測(cè)定 取熊果酸原料藥、大豆卵磷脂各50 mg（摩爾比1 ∶1.1），置于三角燒瓶中，加入35 mL 四氫呋喃，45 ℃下恒溫?cái)嚢?.0 h，40 ℃下減壓旋蒸除去四氫呋喃，即得。

稱取熊果酸、大豆卵磷脂適量（質(zhì)量均為X0），同法制備熊果酸磷脂復(fù)合物，加入適量石油醚振蕩溶解，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，除去游離的熊果酸，收集濾液，40 ℃下減壓旋蒸除去石油醚，收集固體，溶于10 mL 乙腈中，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算熊果酸質(zhì)量（X1）和復(fù)合率，公式為復(fù)合率＝X1／X0×100%，平行3 次，測(cè)得其數(shù)值均接近100%。

參考文獻(xiàn)［13］報(bào)道的方法，取過(guò)量熊果酸及其磷脂復(fù)合物，加入蒸餾水磁力攪拌2 d，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，磷脂復(fù)合物將熊果酸在水中的溶解度由5.36 μg／mL 提高至16.49 μg／mL。同法測(cè)定熊果酸在油酸中的溶解度，發(fā)現(xiàn)它由0.62 mg／mL 提高至11.52 mg／mL。

2.3 熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備取熊果酸磷脂復(fù)合物50 mg、單硬脂酸甘油酯300 mg、油酸60 mg，加入10 mL 乙醇溶解，70 ℃水浴加熱，作為油相；稱取0.2 g 泊洛沙姆188 溶于20 mL 蒸餾水中，加熱至70 ℃，作為水相，設(shè)置攪拌速度為800 r／min，將水相逐滴滴入油相中，再將初乳置于冰水混合物中繼續(xù)攪拌2 h，超聲（600 W）處理6 min（每工作2 s 停止3 s），過(guò)濾后滴加蒸餾水至20 mL，即得，密封低溫保存。以32 mg 磷脂代替熊果酸磷脂復(fù)合物（50 mg 磷脂復(fù)合物中約含32 mg 磷脂），同法制備空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液。

2.4 包封率、載藥量測(cè)定 取1.0 mL 熊果酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液至超速離心管中，平行2 份，置于高速離心機(jī)轉(zhuǎn)子中，10 000 r／min 高速離心45 min，HPLC 法測(cè)定濾液中游離藥量（m游離）。取1.0 mL，加入適量甲醇后超聲處理3 min，定容至10 mL，HPLC 法測(cè)定總藥量（m總量），計(jì)算包封率、載藥量，公式分別為包封率＝ ［（m總量-m游離）／m總量］× 100%、載藥量＝ ［（ m總量-m游離）／（m總脂質(zhì)+m總量）］×100%，其中m總脂質(zhì)表示納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體總質(zhì)量，平行3 次，測(cè)得兩者平均值分別為80.54%、3.57%。

2.5 粒徑、Zeta 電位測(cè)定 取熊果酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液0.2 mL，加入5 mL 蒸餾水稀釋，取適量置于比色皿中，測(cè)得其平均粒徑為（209.32±4.47）nm，PDI 為0.107 ± 0.011，Zeta 電位為-（10.82±0.42）mV，見(jiàn)圖1～2。

2.6 形態(tài)觀察 將熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液適當(dāng)稀釋后，滴加于有支持膜的銅網(wǎng)上，鋪展均勻后放置8 min，于5%磷鎢酸溶液中浸泡6 min，晾干后在透射電鏡（TEM）下觀察其形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，該制劑呈類球形或球形，納米粒之間未粘連。

圖1 熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of nanostructured lipid carriers of ursolic acid phospholipids complex

圖2 熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of nanostructured lipid carriers of ursolic acid phospholipids complex

圖3 熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體TEM 圖Fig.3 TEM image for nanostructured lipid carriers of ursolic acid phospholipids complex

2.7 凍干粉制備及表征 取2 mL 熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液至西林瓶中，加入5%甘露醇作為凍干保護(hù)劑，振蕩一段時(shí)間后置于-60 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍2 d，迅速放入凍干機(jī)中（初始溫度-45 ℃）平衡6 h 后抽真空，保持2 d，4 ℃／h 升至25 ℃，繼續(xù)保持12 h，即得，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)（以熊果酸計(jì)）為1.05%。

2.7.1 粒徑、Zeta 電位 取凍干粉約5 mg，加入40 mL 蒸餾水復(fù)溶，測(cè)得其平均粒徑增大至（276.22±7.04）nm，而平均Zeta 電位為-（8.11±0.53）mV，絕對(duì)值有所下降。

2.7.2 包封率、載藥量 蒸餾水復(fù)溶凍干粉后，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)得其平均包封率為73.83%，載藥量為3.12%。

2.7.3 形態(tài)觀察 取凍干粉適量，置于掃描電鏡（SEM）下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖4，可發(fā)現(xiàn)分布于其中的球形納米粒子。

圖4 凍干粉SEM 圖Fig.4 SEM image for lyophilized powder

2.7.4 體外釋藥 1%十二烷基硫酸鈉溶液制備熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凍干粉混懸液2 mL（含4 mg 熊果酸），置于透析袋（截留分子量8 000～14 000 Da）中；0.5 mL 乙醇溶解熊果酸原料藥后，加入1% 十二烷基硫酸鈉溶液至2 mL（含4 mg 熊果酸），置于透析袋中。以900 mL 1%十二烷基硫酸鈉溶液為介質(zhì)，在轉(zhuǎn)速100 r／min、溫度37 ℃下取樣兩者各3 mL，同時(shí)及時(shí)補(bǔ)加3 mL空白介質(zhì)，測(cè)定熊果酸含量，計(jì)算其累積釋放度，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 熊果酸體外釋藥曲線Fig.5 In vitro drug release curves for ursolic acid

由此可知，熊果酸溶出較快，2 h 內(nèi)溶出度達(dá)95.8%；熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凍干粉在前8 h 釋藥較快，8～36 h 釋藥較慢。再分別采用Higuchi、Weibull、一級(jí)釋放模型對(duì)其釋藥過(guò)程進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)它與Weibull 模型擬合度最高（R2＝0.990 6）。

2.8 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.8.1 色譜、質(zhì)譜條件 ZORBAX SB C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%冰醋酸（80 ∶ 20）；體積流量0.2 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。電噴霧離子源，負(fù)離子模式掃描，范圍m／z 100～1 000；霧化氣壓力308.17 kPa；干燥氣溫度325 ℃；毛細(xì)管電壓-3 000 V；定量分析離子m／z 469.3（甘草次酸）、 m／z 455.3（熊果酸）。

2.8.2 灌胃液制備 取熊果酸、熊果酸磷脂復(fù)合物、熊果酸磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凍干粉適量，加入0.5%CMC-Na 溶液，即得（以熊果酸計(jì)，質(zhì)量濃度為12.5 mg／mL）。

2.8.3 給藥、取血、血漿樣品處理 12 只大鼠隨機(jī)分為2 組，實(shí)驗(yàn)期間禁食不禁水，按100 mg／kg（以熊果酸計(jì)）劑量灌胃給予“2.8.2”項(xiàng)下灌胃液，乙醚麻醉后于0.25、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h 眼眶靜脈叢取血各約0.3 mL，置于肝素化離心管中，用力振蕩后3 000 r／min 離心2 min，低溫冷凍保存血漿。吸取血漿樣品200 μL、內(nèi)標(biāo)溶液（精密稱取甘草次酸對(duì)照品10.0 mg，溶于100 mL 乙腈后得0.1 mg／mL 母液，乙腈稀釋至50.0 ng／mL，即得）50 μL、乙酸乙酯1.5 mL，渦旋混勻6 min，5 000 r／min 離心10 min，取出有機(jī)相，45 ℃氮?dú)饬骶徛蹈珊蟮脷堅(jiān)刂拼邓伲?，加?00 μL 甲醇復(fù)溶，渦旋1 min，5 000 r／min 繼續(xù)離心5 min，轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯管中，在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。

2.8.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下10.0 μg／mL對(duì)照品溶液，乙腈依次稀釋至15.0、60.0、120.0、240.0、360.0、480.0、960.0 ng／mL，各取200 μL，加入50 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，40 ℃氮?dú)饬骶徛蹈珊蠹尤?00 μL 空白血漿，即得血漿對(duì)照品溶液，按“2.8.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以熊果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），熊果酸、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y ＝1.307 8X+12.057 4（r ＝0.990 7），在15.0～960.0 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.5 專屬性試驗(yàn) 取空白血漿、血漿對(duì)照品溶液（15 ng／mL）、血漿樣品溶液（凍干粉灌胃給藥12 h 后），在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6，可知該方法專屬性良好。

2.8.6 提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 制備30.0、300.0、600.0 ng／mL 質(zhì)控樣品溶液，按“2.8.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定峰面積（ρ1）；取空白血漿200 μL，除不加內(nèi)標(biāo)外按“2.8.3”項(xiàng)下方法處理，于殘?jiān)屑尤?0.0、300.0、600.0 ng／mL 質(zhì)控樣品溶液和內(nèi)標(biāo)，在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定峰面積（ρ2）；取30.0、300.0、600.0 ng／mL 質(zhì)控樣品溶液，在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定峰面積（ρ3），根據(jù)公式ρ1／ρ2×100%計(jì)算提取回收率，ρ2／ρ3×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果，熊果酸提取回收率分別為88.62%、89.05%、86.66%，內(nèi)標(biāo)提取回收率為90.27%；前者基質(zhì)效應(yīng)分別為93.59%、92.23%、95.69%，后者基質(zhì)效應(yīng)為94.84%。

2.8.7 精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn) 取15.0、240.0、960.0 ng／mL 血漿對(duì)照品溶液，1 d 內(nèi)在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得其峰面積RSD 分別為12.37%、8.02%、4.97%，表明儀器精密度良好。室溫下將血漿樣品溶液于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得其峰面積RSD 為7.74%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取15.0 ng／mL 血漿對(duì)照品溶液（不加內(nèi)標(biāo)），逐步稀釋，以S／N≥3 為檢測(cè)限，S／N≥10為定量限，測(cè)得兩者分別為1.5、5.0 ng／mL。由此可知，上述結(jié)果均符合2020 年版《中國(guó)藥典》四部9012 項(xiàng)下生物樣品定量分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則。

2.8.8 結(jié)果分析 血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖7，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。由此可知，將熊果酸制成磷脂復(fù)合物后tmax略有延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P ＜0.01），進(jìn)一步制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體后tmax更長(zhǎng)（P ＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞更高（P ＜0.01）；與磷脂復(fù)合物比較，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體tmax延長(zhǎng)（P ＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01）；與原料藥比較，磷脂復(fù)合物、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體相對(duì)生物利用度分別增加至2.73、3.95 倍。

圖7 熊果酸血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.7 Plasma concentration-time curves for ursolic acid

表1 熊果酸主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for ursolic acid（，n＝6）

表1 熊果酸主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for ursolic acid（，n＝6）

注：與熊果酸比較，??P＜0.01；與熊果酸磷脂復(fù)合物比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3 討論

難溶性藥物進(jìn)入機(jī)體后，需經(jīng)溶解、溶出、透膜吸收才能進(jìn)入體循環(huán)，從而發(fā)揮藥效［14-16］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將熊果酸制成磷脂復(fù)合物后，該成分在水中的溶解度由5.36 μg／mL 升至16.49 μg／mL，并且Cmax、AUC0～t、AUC0～∞顯著升高，相對(duì)生物利用度也增加至2.73 倍，可促進(jìn)藥物吸收。

由于磷脂復(fù)合物在胃腸道環(huán)境中容易發(fā)生解離，穩(wěn)定性也存在一定問(wèn)題［12，17］，故本實(shí)驗(yàn)以單硬脂酸甘油酯為固體脂質(zhì)，油酸為液態(tài)脂質(zhì)，將其進(jìn)一步制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，一方面可對(duì)包裹于其中的磷脂復(fù)合物提供保護(hù)作用，有助于提高藥物生物利用度；另一方面，可發(fā)揮納米制劑促進(jìn)藥物吸收的作用［12，18］。結(jié)果，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的相對(duì)生物利用度增加至3.95 倍，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞顯著升高，tmax顯著延長(zhǎng)，可能是由于該劑型緩釋作用所致，可為今后藥效學(xué)研究奠定基礎(chǔ)［19-21］。