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基于臨界分離效應的復雜溶液環(huán)境中丹酚酸B、苦參堿納濾分離規(guī)律

2021-03-09 10:11:16葉淑青伍清萍鄭雨君許啟龍鄒雨岑李存玉董政起
中成藥 2021年2期
關鍵詞:納濾苦參堿濾膜

葉淑青 伍清萍 鄭雨君許啟龍鄒雨岑李存玉 董政起

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇南京 210023;2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023;3.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所,北京 100193)

中藥復方提取液中成分及其存在狀態(tài)復雜多樣,決定了藥效,并影響了分離精制,尤其是在酸堿類成分共存的溶液體系下,熱處理濃縮了破壞物質基礎[1]。納濾具有常溫分離的特點,而在酸堿共存溶液環(huán)境中成分之間形成復合物、締合物而改變其存在狀態(tài)[2],導致影響分離,并難以通過經(jīng)典分離理論指導應用。在課題組前期開發(fā)用于治療人體乳頭瘤病毒的丹參-苦參藥對基礎上,本實驗通過納濾改善精制環(huán)節(jié)中因熱處理引起酚酸轉化、生物堿轉移率下降的技術難題,并探索復雜溶液環(huán)境下酸堿類成分的分離規(guī)律。

根據(jù)前期報道[3]結合生產(chǎn)目的,本實驗采用微濾預處理改善溶液可濾性,在納濾電荷效應、孔徑篩分的作用下采用乙醇調(diào)節(jié)Donnan 效應,以納濾孔徑、乙醇體積分數(shù)、pH 為影響因素,通過Box-Behnken 響應面法建立數(shù)學模型[4],結合丹參-苦參藥對中有效成分的結構特點,以苦參堿、丹酚酸B 截留率為評價指標,分析溶液環(huán)境對酸堿共存溶液體系下成分分離的影響,以期為協(xié)同精制藥對提取液中2 種成分提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 苦參(批號1706022)、丹參(批號17021001)飲片購自安徽普仁中藥飲片有限公司,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學嚴輝副教授鑒定分別為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根、唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖,符合2020 年版《中國藥典》[5]相關項下要求。復合聚酰胺納濾膜(孔徑150、400、600、800、1 000 Da,有效過濾面積0.30 m2,1812 型卷式膜),購自南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司??鄥A對照品(批號110805-201709,純度>98%)購自中國食品藥品檢定研究院;丹酚酸B 對照品(批號P18J9F65871,純度>98%)購自上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純;其他試劑均為分析純;水為純化水。

1.2 儀器 TNZ-1 型納濾中壓分離設備,購自南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司;Waters e2695 型高效液相色譜儀,配置2998 PDA 檢測器,購自美國Waters 公司;EPED-Z1-10T 型實驗室級純水器,購自南京易普易達科技發(fā)展有限公司;AL204 型電子天平(萬分之一),購自瑞士Mettler-Toledo 公司;PB-10 型PH 計,購自德國Sartorius 公司;KH-250B 型超聲波清洗器,購自昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 復方提取液 稱取苦參、丹參飲片,加入10 倍量純化水提取2 次,每次1.5 h,0.45 μm 板框微孔濾膜過濾,合并濾液,即得(苦參堿、丹酚酸B 質量濃度分別為387.6、4 230.5 μg/mL)。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取干燥至恒定質量的苦參堿、丹酚酸B 對照品適量,分別置于10、5 mL 量瓶中,甲醇稀釋至刻度,即得(2 種成分質量濃度分別為1.02、0.85 g/L)。

2.2 納濾操作 采用耐高壓管路連接納濾中壓分離設備中的中壓泵、壓力表、流速閥、納濾膜、截留閥,將復方提取液置于儲液罐中,按照實驗設計要求調(diào)節(jié)溶液pH。選擇相應孔徑的納濾膜,通過流速閥、截留閥控制跨膜壓力差。將復方提取液置于納濾分離系統(tǒng)內(nèi)進行循環(huán)平衡,收集單位時間(t)納濾液端溶液體積(V),計算通量Jv,公式為Jv=V/(t·有效過濾面積),使溶質與納濾膜吸附平衡,取樣平衡液后收集納濾端溶液,納濾完成后取樣納濾液。

2.3 樣品檢測

2.3.1 色譜條件

2.3.1.1 苦參堿 Agilent NH2色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相乙腈-無水乙醇-3% 磷酸(80 ∶10 ∶10);體積流量1 mL/min;檢測波長220 nm;進樣量10 μL。

2.3.1.2 丹酚酸B 參考文獻 [5]報道。Scientific C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相乙腈(A)-水(含0.05%磷酸)(B),梯度洗脫(0~15 min,10%~20% A;15~35 min,20%~25% A;35~45 min,25%~30% A;45~55 min,30%~90%A);體積流量1 mL/min;檢測波長286 nm;進樣量10 μL。

2.3.2 線性關系考察 精密吸取苦參堿、丹酚酸B對照品溶液各0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL,分別置于2 個5 mL 量瓶中,50%甲醇定容至刻度,在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標(Y),各成分質量濃度為橫坐標(X)進行回歸,得方程分別為苦參堿Y =4×106X-37 784(r=0.999 2),在20.4~408.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好;丹酚酸B Y =1×107X+123 780(r=0.999 4),在17.0~340.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4 截留率測定 精密吸取納濾分離過程中產(chǎn)生的平衡液、納濾液,在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定,計算截留率,公式為截留率=(1-C1/C2)×100%,其中C1為納濾液中待測成分質量濃度,C2為平衡液中待測成分質量濃度。

2.5 單因素試驗

2.5.1 乙醇體積分數(shù) 設定納濾分離固定參數(shù)為膜孔徑 800 Da,溶液 pH 5.0,跨膜壓力差1.0 MPa,考察乙醇體積分數(shù)0、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%、40.0%對苦參堿、丹酚酸B 截留率的影響。

2.5.2 跨膜壓力差 設定納濾分離固定參數(shù)為膜孔徑800 Da,溶液pH 5.0,乙醇體積分數(shù)0,考察跨膜壓力差0.5、1.0、1.5、2.0 MPa 對苦參堿、丹酚酸B 截留率的影響。

2.5.3 膜孔徑 設定納濾分離固定參數(shù)為溶液pH 5.0,乙醇體積分數(shù)0,跨膜壓力差1.0 MPa,考察膜孔徑150、400、600、800、1 000 Da 對苦參堿、丹酚酸B 截留率的影響。

2.5.4 溶液pH 設定納濾分離固定參數(shù)為孔徑800 Da,乙醇體積分數(shù)0,跨膜壓力差1.0 MPa,考察溶液pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 對苦參堿、丹酚酸B 截留率的影響。

2.6 Box-Behnken 響應面法 根據(jù)Box-Behnken 中心組合設計原理[6],結合單因素試驗結果,選擇乙醇體積分數(shù)(A)、膜孔徑(B)、溶液pH(C)作為影響因素,以-1、0、1 代表水平,因素水平見表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

3 結果

3.1 單因素試驗

3.1.1 乙醇體積分數(shù) 圖1 顯示,丹酚酸B、苦參堿截留率均隨著乙醇體積分數(shù)增加而升高,與溶質和納濾膜之間電荷效應、孔徑溶脹效應變化存在相關性[7-8]。

圖1 乙醇體積分數(shù)對丹酚酸B、苦參堿截留率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on rejection rates of salvianolic acid B and matrine

3.1.2 跨膜壓力差 圖2 顯示,通量與跨膜壓力差的線性方程回歸系數(shù)為0.957,表明壓力差超過1.5 MPa 后復方提取液納濾分離時出現(xiàn)濃差極化[9],從而影響納濾膜通量。同時,壓力差對成分截留率均呈現(xiàn)一定的正相關。

3.1.3 膜孔徑 圖3 顯示,隨著膜孔徑增加,各成分截留率降低,符合孔徑篩分理論[10]。

3.1.4 溶液pH 圖4 顯示,隨著溶液pH 由3.0增加至8.0,在電荷排斥作用下[6]逐步解離的丹酚酸B 截留率隨之升高,而有離子態(tài)向分子態(tài)過渡的苦參堿截留率下降,并趨于穩(wěn)定。

圖2 跨膜壓力差對丹酚酸B、苦參堿截留率、通量的影響Fig.2 Effects of transmembrane pressure difference on rejection rates and fluxes of salvianolic acid B and matrine

圖3 膜孔徑對丹酚酸B、苦參堿截留率的影響Fig.3 Effects of membrane aperture on rejection rates of salvianolic acid B and matrine

圖4 溶液pH 對丹酚酸B、苦參堿截留率的影響Fig.4 Effects of solution pH on rejection rates of salvianolic acid B and matrine

3.2 Box-Behnken 響應面法 結果見表2,通過Design-Expert 10.0.4 軟件對相關數(shù)據(jù)進行擬合,得丹酚酸B(Y1)、苦參堿(Y2)截留率的二次多項回歸方程分別為Y1=90.78-0.29A-9.37B+6.34C-2.23AB+2.15AC+5.57BC-1.34A2-4.17B2+1.60C2、 Y2=42.58+4.89A -20.93B -18.84C -5.60AB -6.98AC+7.70BC+0.77A2-2.90B2-1.68C2,方差分析見表3。由此可知,丹酚酸B 截留率的F 值為45.79,R2為0.983 3,P<0.01,表明模型高度顯著;各因素影響程度依次為B>C>A,其中B、 C 有顯著影響(P<0.05);AB、 AC、 BC均有顯著影響(P<0.05),而苦參堿截留率的F 值為53.97,R2為0.985 8,P<0.01,表明模型高度顯著;各因素影響程度依次為B>C>A;AB、 AC、BC 均有顯著影響(P<0.05)。

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

綜上所述,膜孔徑在分離過程中具有主導地位,其孔徑尺寸決定了成分分離行為;溶液pH 通過調(diào)節(jié)酸堿類成分解離-游離比例來改變納濾膜表面電荷效應,從而具有調(diào)控分離的作用;與丹酚酸B 比較,苦參堿對乙醇體積分數(shù)的變化相對敏感,從而對其分離具有顯著影響。

丹酚酸B 截留率的等高線圖見圖5。由此可知,在膜孔徑或溶液pH 相對固定的前提下,隨著乙醇體積分數(shù)升高,該成分截留率均先降低后升高,表明溶劑組成可改變其存在狀態(tài),調(diào)節(jié)其分離情況;隨著溶液pH 升高,該成分逐步解離,在電荷排斥作用下其截留率增加;膜孔徑小于480 Da時,在一定溶液pH 范圍內(nèi)該成分均保持較高的截留率,此時其分子尺寸大于膜孔徑,而隨著納濾膜孔徑增加其截留率隨之降低。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖5 丹酚酸B 截留率等高線圖Fig.5 Contour maps for rejection rate of salvianolic acid B

苦參堿截留率的等高線圖見圖6。由此可知,隨著膜孔徑或溶液pH 升高,該成分截留率均降低,符合孔徑篩分和電荷效應;乙醇體積分數(shù)升高時,納濾膜需要提供更大的膜孔徑才可降低該成分截留率,與前期報道的有機溶劑強化Donnan 效應相符[12],但作用更強。

結合前期研究[12-13]考察納濾分離因素,結果見圖7。由此可知,復方水提液中苦參堿截留率高于苦參提取液中,其中前者在pH 4.0~5.2 范圍內(nèi)隨著膜孔徑增加,該成分截留率變化更明顯,依次穿過代表截留率的等高線,而后者也表現(xiàn)出相同趨勢;當pH 接近7.0 時,苦參提取液仍表現(xiàn)出上述趨勢,而復方提取液呈現(xiàn)截留率穩(wěn)步下降的趨勢。以pH 6.4 時復方提取液中苦參堿截留率變化為例,當納濾膜孔徑低于560 Da 時,該成分截留率相對穩(wěn)定,表明在固定溶液酸堿度時隨著納濾膜孔徑逐步增大,溶液中以某種狀態(tài)存在的苦參堿透過孔徑條件逐步滿足,出現(xiàn)截留率先穩(wěn)定后下降的臨界分離效應。

綜上所述,乙醇體積分數(shù)對苦參堿分離情況影響顯著,在一定溶液pH 下隨著其體積分數(shù)增加,膜孔徑不斷升高,臨界分離效應隨之出現(xiàn)。因此,在納濾分離中藥成分時可通過調(diào)節(jié)溶劑組成來改變臨界分離效應,從而為復雜溶液環(huán)境下目標成分的分離提供技術支撐。

4 討論

圖6 苦參堿截留率等高線圖Fig.6 Contour maps for rejection rate of matrine

在含有乙醇的溶液環(huán)境下,丹酚酸B、苦參堿的臨界分離效應存在差異,與兩者狀態(tài)具有相關性。復方提取液中含有丹參酚酸(丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B 等)、苦參生物堿(苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐定堿等),其中在酸堿類成分相互締合、復合的作用下,丹酚酸B表現(xiàn)出較弱的臨界分離效應,結合成分的納濾分離規(guī)律可知,該成分主要以分子態(tài)、離子態(tài)形式存在,與苦參生物堿締合、復合的比例相對偏低;苦參堿以分子態(tài)、離子態(tài)、締合態(tài)、復合態(tài)多狀態(tài)共存[14]。

圖7 納濾分離因素等高線圖Fig.7 Contour maps for nanofiltration separation factors

基于納濾分離的孔徑篩分效應和臨界分離效應,在水溶液環(huán)境下固定溶液pH,當苦參堿截留率相對穩(wěn)定時,該成分以分子態(tài)、離子態(tài)形式進行納濾分離。當納濾膜孔徑滿足臨界分離效應時,苦參堿與丹參酚酸B 形成的締合物、復合物可透過納濾膜,出現(xiàn)截留率下降的分離現(xiàn)象,推測復方提取液中該成分可能主要與咖啡酸等小分子酚酸形成復合物。

溶質-膜材質-溶劑之間的相互作用決定了分離情況,溶劑由水向乙醇過渡,由于溶液表面張力下降,故乙醇更容易接近膜界面層。隨著乙醇體積分數(shù)增加,苦參堿截留率升高,乙醇組成的界面層厚度也可能變大,占據(jù)部分納濾膜孔道,導致有效過濾孔徑下降,納濾膜孔徑需要增加至一定程度才能出現(xiàn)臨界分離效應。因此,改變?nèi)軇┙M成可調(diào)控限域環(huán)境下的有效過濾孔徑,為復雜溶液體系中成分的策略性分離提供技術支撐。

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