何 艷，汪 毅，李 敏，王 惠

（1.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南郴州 423000；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

藿香清胃片、藿香清胃膠囊、藿香清胃顆粒由廣藿香、梔子、防風(fēng)、南山楂、六神曲、石膏、甘草加工而成，具有清熱化濕、醒脾消滯之功效，臨床上用于治療消化不良、脘腹脹滿等癥。方中廣藿香芳香化濕、醒脾悅胃；梔子、石膏清瀉脾胃積熱，共為君藥；防風(fēng)疏脾散濕、調(diào)脾養(yǎng)胃，為臣藥；南山楂、六神曲消食化滯，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥［1］。目前，對(duì)藿香清胃系列制劑的質(zhì)量控制主要是廣藿香、南山楂的TLC 定性鑒別，部分標(biāo)準(zhǔn)中增加了梔子苷含量測(cè)定，但質(zhì)控指標(biāo)單一、不一致；相關(guān)文獻(xiàn)也僅限于對(duì)單一劑型中某一種或某幾種指標(biāo)成分進(jìn)行定量測(cè)定［2-8］，尚無(wú)統(tǒng)一的含量測(cè)定方法。因此，本實(shí)驗(yàn)在參照中藥質(zhì)量標(biāo)志物原則的基礎(chǔ)上［9］，選擇君藥梔子主要成分梔子苷［10］、臣藥防風(fēng)主要成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷［11］、使藥甘草主要成分甘草酸［12］作為指標(biāo)成分，采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定四者含量，以期為該系列制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置G1311B 四元泵、G1329B 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A 柱溫箱、G1315D DAD 檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技公司）；KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XSE-205 電子天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 超純水儀（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試劑與藥物 梔子苷（批號(hào)110749-201617，純度98.4%）、升麻素苷（批號(hào)111522-201511，純度94.8%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)111523-201509，純度95.8%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-201720，純度97.7%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。藿香清胃片、藿香清胃膠囊、藿香清胃顆粒共13 批，具體信息見表1。乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Atlantis T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～15% A；10～25 min，15%～19% A；25～30 min，19% A；30～45 min，19%～45% A；45～50 min，45% A；50～51 min，45%～10%A；51～55 min，10%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品梔子苷14.52 mg、升麻素苷5.31 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷5.21 mg、甘草酸銨13.74 mg（甘草酸質(zhì)量＝甘草酸銨質(zhì)量／1.020 7），分別置于4 個(gè)25 mL 量瓶中，70%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到貯備液，分別精密吸取6、1、1、1 mL，置于同一10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（4 種成分質(zhì)量濃度分別為342.9、20.14、19.96、52.61 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取片劑10 片（除去薄膜衣或糖衣）、膠囊10 粒（內(nèi)容物）、顆粒10 袋（內(nèi)容物），研細(xì)，3 種劑型分別精密稱取0.7、0.5、1 g，置于錐形瓶中，精密加入70% 甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（300 W、40 kHz）處理30 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，濾液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按片劑處方工藝，分別制備缺梔子、缺防風(fēng)、缺甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液中4 種成分色譜峰的分離度均大于1.5，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于6 個(gè)10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，各精密吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液5 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得梔子苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸峰面積RSD 分別為0.25%、0.75%、0.46%、1.34%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)20191108），于0、6、12、18、24、30 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得梔子苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸峰面積RSD 分別為1.29%、1.54%、1.86%、1.69%，表明供試品溶液在30 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批片劑（批號(hào)20191108）、膠囊（批號(hào)20200403）、顆粒（批號(hào)9J02），按“2.2.2”項(xiàng)下方法各制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得片劑中梔子苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸含量RSD 分別為0.87%、0.95%、0.84%、1.74%，膠囊中分別為0.41%、1.65%、1.70%、2.48%，顆粒中分別為1.02%、2.79%、2.72%、0.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的同一批片劑（批號(hào)20191108）適量，研細(xì)，取約0.35 g，精密稱定6 份，按100%水平精密加入對(duì)照品溶液（0.612 0 mg／mL 梔子苷4 mL、0.150 9 mg／mL升麻素苷1 mL、0.170 1 mg／mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷1 mL、0.132 5 mg／mL 甘草酸4 mL），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測(cè)定 取藿香清胃系列制劑，每批精密稱取2 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各吸取10 μL 進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，并折算成每日服用量，結(jié)果見表4。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝2）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分篩選 本實(shí)驗(yàn)前期曾測(cè)定藿香清胃片中另一君藥廣藿香中毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷［13-14］的含量，發(fā)現(xiàn)其數(shù)值較低，重復(fù)性較差，故未納入本實(shí)驗(yàn)中。

3.2 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測(cè)器在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)各種成分在240 nm 處均有較大吸收，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。參考文獻(xiàn)［7，15-16］報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1% 磷酸梯度洗脫時(shí)各成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對(duì)稱因子為1.04～1.10，色譜峰對(duì)稱性良好，故選擇其作為流動(dòng)相。

3.3 提取方法篩選 本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑（100%、70%、50% 甲醇，95%、70%、50% 乙醇）、提取方法（超聲、加熱回流）、提取時(shí)間（20、30、40、50 min）對(duì)各成分提取率的影響，發(fā)現(xiàn)70%甲醇超聲提取30 min 時(shí)供試品溶液基線平穩(wěn)，干擾雜質(zhì)少，各成分提取量最高，峰形良好，故選擇其作為提取方法。

3.4 含量分析 表1 顯示，藿香清胃片、藿香清胃膠囊、藿香清胃顆粒規(guī)格參差不齊，僅憑質(zhì)量分?jǐn)?shù)不能準(zhǔn)確反映各劑型之間的質(zhì)量差異，故本實(shí)驗(yàn)以每日服用量為依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同廠家、劑型中各成分每日服用量差異較大，以梔子苷最顯著，高達(dá)12 倍。因此，亟需建立藿香清胃系列制劑通用標(biāo)準(zhǔn)，以期確保其臨床療效的穩(wěn)定性。