郭亮亮，靳寧寧，王瑩，張靜

(鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001)

殼聚糖價廉易得，止血性[1]、生物相容性良好[2-3]，可廣譜抗菌[4]、促進(jìn)傷口愈合。殼聚糖經(jīng)N-烷基化改性后，既保留了其優(yōu)良活性，又增強(qiáng)了其止血性能[5-7]。白芨多糖是從傳統(tǒng)中藥白芨中提取出的水溶性多糖，可收斂止血、消腫生肌[8-10]，具有多種生理活性[11-13]。離子交聯(lián)法在制備殼聚糖復(fù)合材料過程中，避免了有毒副作用的交聯(lián)劑的使用，是制備止血材料的理想方法[14]。

本文使用離子交聯(lián)法制備負(fù)載有白芨多糖的N-烷基化殼聚糖凍干粉，以期結(jié)合二者的止血性能，利用凍干粉的特性，在達(dá)到止血目的的基礎(chǔ)上同時起到一定的止痛作用[15]。

1 實驗部分

1.1試劑與儀器

殼聚糖(CTS)、三聚磷酸鈉、硼氫化鈉、氫氧化鈉、冰乙酸、無水乙醇均為分析純；十二醛(95%)，色譜純；白芨多糖(Bsp，多糖含量50%)，由陜西森弗天然制品有限公司提供；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為生物試劑。

SHZ-D(Ш)水循環(huán)式真空泵；PHS-25數(shù)字pH計；Φ130×60 ZNCL-GS智能磁力攪拌器；DZF-6020真空干燥箱；AB204-N電子分析天平；Nicolet IR300傅里葉變換紅外光譜儀；S-4700場發(fā)射掃描電鏡；Nanoplus3 Nanoplus納米粒度與Zeta電位分析儀。

1.2 實驗方法

1.2.1N-烷基化殼聚糖(N-CTS)制備 稱取CTS粉末2 g，配制質(zhì)量濃度1%的CTS醋酸溶液，靜置除泡備用。將0.55 mL十二醛逐滴加入殼聚糖溶液，攪拌12 h后調(diào)節(jié)pH=5。配制質(zhì)量濃度10%的硼氫化鈉水溶液，強(qiáng)攪拌下將硼氫化鈉水溶液逐滴加入反應(yīng)體系，2 h后調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH=7，用無水乙醇反復(fù)洗滌抽濾，真空干燥研磨可得N-CTS粉末。

1.2.2N-烷基化殼聚糖/白芨多糖復(fù)合材料(N-CTS/Bsp)制備 以質(zhì)量濃度3%的醋酸溶液為溶劑，配制一定濃度N-CTS醋酸溶液，靜置除泡備用。同樣地，配制一定濃度Bsp醋酸溶液，過濾以除去不溶性雜質(zhì)。配制1 mg/mL三聚磷酸鈉(TPP)溶液作為交聯(lián)劑備用。將N-烷基化殼聚糖溶液與白芨多糖溶液共混，并持續(xù)攪拌2 h。調(diào)節(jié)共混液pH=5，330 r/min轉(zhuǎn)速下，將TPP溶液逐滴加入到共混液，滴加完成后，保持該轉(zhuǎn)速一段時間，之后靜置沉淀。將絮狀沉淀離心，除去上層清液，沉淀層冷凍干燥即可得到N-CTS/Bsp。

1.3 N-烷基化殼聚糖的表征

1.3.1 紅外光譜分析 采用KBr壓片法，將N-CTS、CTS粉末與溴化鉀粉末混合研磨壓片，使用紅外分光光度計進(jìn)行掃描，將二者紅外光譜圖進(jìn)行對比分析。

1.3.2 元素分析 取N-CTS、CTS粉末，使用掃描電鏡所附帶的X射線能譜元素分析功能對其進(jìn)行元素分析。分別測量出N-CTS以及CTS中碳、氮兩種元素的分布以及元素百分比，進(jìn)而計算出N-CTS的取代度。

其中，C/N為測量所得碳氮比，α為殼聚糖的脫乙酰度，SD為N-烷基化殼聚糖的取代度。

1.4 復(fù)合凍干粉的表征

1.4.1 紫外光譜測定 取Bsp原料以及所制備的復(fù)合凍干粉分散溶于3%乙酸水溶液，形成2 mg/mL的Bsp醋酸溶液以及復(fù)合凍干粉醋酸溶液，使用紫外分光光度計研究其紫外吸收情況。

1.4.2 掃描電鏡測定 取所制備的復(fù)合凍干粉，首先放入50 ℃恒溫干燥箱進(jìn)行干燥處理，噴金后使用掃描電鏡對復(fù)合凍干粉的形貌進(jìn)行觀察。

1.4.3 凍干粉粒徑測定 取所制備的復(fù)合凍干粉，分散于無水乙醇中，超聲一段時間后靜置，取上清液用納米粒度分析儀對所制備復(fù)合凍干粉粒徑分布進(jìn)行測試分析。

1.5 復(fù)合凍干粉的性能研究

1.5.1 吸水性測定 稱取一定質(zhì)量所制備的凍干粉，于70 ℃烘箱中干燥至恒重，稱重記為W1。將凍干粉置于生理鹽水中，待凍干粉吸水達(dá)到平衡，取出凍干粉，將吸水后的凍干粉置于一定坡度玻璃板瀝水，稱取瀝水后凍干粉的重量，記為W2，則凍干粉吸水性(%)可用以下公式計算：

1.5.2 降解性測定 用失重法測定凍干粉的降解性。配制磷酸鹽緩沖液(PBS)，稱取溶菌酶，溶解到PBS溶液中形成降解液(溶菌酶4 mg/mL)。稱取復(fù)合凍干粉干燥至恒重，稱重記為M1。取西林瓶編號并稱重記為M2，將凍干粉置于盛有一定體積降解液的西林瓶中，緩慢搖動，使得凍干粉與降解液充分接觸。將西林瓶(含降解液及凍干粉)置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱降解，及時更新西林瓶內(nèi)的降解液。用去離子水重復(fù)洗滌幾次，烘干稱重記為M3。凍干粉的失重率(%)可用以下公式進(jìn)行計算：

1.5.3 抑菌性測定 采用擴(kuò)散法測定復(fù)合材料的抑菌性。配制復(fù)合材料原液，將滅菌后的紙片放入復(fù)合材料液，輕微振蕩，使紙片完全沒入材料液內(nèi)，一段時間后將紙片取出，于超凈工作臺中風(fēng)干待用。

選取大腸桿菌作為革蘭氏陽性菌代表、金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陰性菌代表，配制106CFU/mL的菌懸液，用移液槍轉(zhuǎn)移200 μL菌懸液到固體培養(yǎng)基，涂布均勻，將負(fù)載有復(fù)合材料的紙片貼于培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，一段時間后觀察材料周圍抑菌圈出現(xiàn)情況，對復(fù)合止血材料的抑菌性進(jìn)行評價。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1 殼聚糖和N-烷基化殼聚糖紅外光譜

2.2 元素分析

圖2為原料CTS以及烷基化產(chǎn)物N-CTS分子中C、N元素的分布，圖3為每種樣品中C、N元素的占比情況。

圖2 殼聚糖和N-烷基化殼聚糖C、N元素分布

圖3 殼聚糖和N-烷基化殼聚糖C、N元素分析

表1列出了原料CTS以及N-CTS中碳、氮原子百分比，由元素分析，測定了N-烷基化殼聚糖的取代度，同時也進(jìn)一步證實了烷基醛與殼聚糖成功接枝。

表1 殼聚糖和N-烷基化殼聚糖參數(shù)

2.3 紫外光譜分析

由圖4可知，白芨多糖原料醋酸溶液(a)在 259 nm 處取得最大吸光度，在233 nm處取得第二個吸收峰；樣品c(白芨多糖與N-烷基化殼聚糖投料質(zhì)量比分別為1∶4，b1w4，下同)與樣品b(b3w2)同樣在259 nm處取得最大吸光度，其中樣品b在 232 nm 處取得第二個吸收峰，樣品c在231 nm處取得第二個吸收峰，說明所制備的復(fù)合凍干粉成功負(fù)載了白芨多糖。此外，樣品中白芨多糖的負(fù)載量隨投料比增大而增大。

圖4 白芨多糖、凍干粉紫外光譜

2.4 掃描電鏡分析

圖5與圖6分別為復(fù)合凍干粉b1w4與b4w1的掃描電鏡的圖像。圖5中，A與B為b1w4凍干粉放大30 000倍后的形貌，可看出該凍干粉呈現(xiàn)出多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有較為豐富的孔道，這為其吸附血液提供了足量的場合及較大表面積；C與D為凍干粉放大10 000倍后的形貌，可以看出，凍干粉表面凸凹不平，這為其與血液中血小板以及血漿蛋白的相互作用提供便利。圖6中，從A到D分別為b4w1凍干粉從放大30 000倍到2 000倍后的形貌。可明顯看出，該凍干粉表面具有大量的突起，分布均勻，且該突起所形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為豐富，這些突起可能是與N-烷基化殼聚糖復(fù)合后的大量白芨所形成。這些突起使得復(fù)合凍干粉在與血液接觸后，白芨多糖迅速溶解并參與到凝血過程中，從而加速凝血實現(xiàn)快速凝血成為了可能。此外，大量的突起與孔道結(jié)構(gòu)，也有助于凍干粉可以更好地吸附紅細(xì)胞、血小板并與纖維蛋白作用，加速止血。

圖5 b1w4凍干粉掃描電鏡

圖6 b4w1凍干粉掃描電鏡

2.5 凍干粉粒徑分析

由圖7可知，兩種原料比例復(fù)合凍干粉的粒徑分布均較為集中，其中b1w4平均粒徑為14.79 μm，b4w1平均粒徑為10.18 μm。b1w4平均粒徑稍大于b4w1，即隨著凍干粉中N-烷基化殼聚糖占比增加，凍干粉粒徑隨之增大。這可能是由于在凍干粉中，N-烷基化殼聚糖比例越高，其與交聯(lián)劑交聯(lián)所形成的沉淀體積越大，沉淀負(fù)載的白芨多糖隨之增加，造成凍干粉粒徑增加。同時可得出，所制備凍干粉粒徑與紅細(xì)胞相近。

圖7 凍干粉粒徑分析

2.6 吸水性分析

良好的吸水性，可一定程度上反映出復(fù)合材料的血液吸附能力。由圖8可知，隨著白芨多糖添加比例增加，復(fù)合凍干粉的吸水率先升高后降低，在w3b2時達(dá)到最大值340.2%。這可能是由于當(dāng)N-CTS占投料比例最高(w4b1)時，所形成沉淀所含N-CTS比例最高，N-CTS與交聯(lián)劑所形成的網(wǎng)絡(luò)多孔結(jié)構(gòu)具有一定強(qiáng)度，且占沉淀比重較大，凍干粉吸水溶脹受到一定限制，吸水率相對較高；當(dāng)N-CTS與Bsp的比例為3∶2時，沉淀中N-CTS占比適中，強(qiáng)度較w4b1稍低，該沉淀溶脹性能較高，所含Bsp比例適度，故此時沉淀吸水率最高；在w2b3及w1b4時，沉淀中N-CTS占比較低，沉淀結(jié)構(gòu)較為松散，Bsp雖有一定吸水能力，但此時所負(fù)載的Bsp量并未隨著其投料量的增加而明顯增加，所形成的沉淀未能吸附更多的液體，故此時沉淀的吸水性較低。

圖8 凍干粉吸水率隨原料比例變化

2.7 降解性分析

降解性對于生物材料至關(guān)重要。復(fù)合材料降解過快時，可能造成二次出血等癥狀；復(fù)合材料降解過慢則會影響創(chuàng)面的正常愈合。良好的復(fù)合材料應(yīng)具備適宜的降解速率。由圖9可知，各個樣品在第一周降解較為迅速，之后降解速度略微降低，但仍降解較快。其中凍干粉w1b4，即凍干粉中Bsp含量較高時，該凍干粉降解速率最高，四周可降解75%左右，與之相比，凍干粉 w4b1降解稍慢，4周降解近60%。凍干粉在第1周與其之后降解速率的差異，可能是凍干粉內(nèi)部Bsp易溶解且易降解引起。凍干粉內(nèi)的白芨多糖具有良好的水溶性，在降解第1周時，大量Bsp溶解進(jìn)入降解液，被快速降解，加之部分N-CTS同時被降解，故第1周降解速率較之后快。在第2周及之后，大部分Bsp已被降解，雖然N-CTS持續(xù)被降解，但其降解速率低于Bsp，故降解速率較之前低。

圖9 凍干粉降解隨原料比例變化

2.8 抑菌性分析

圖10中，A為復(fù)合材料對大腸桿菌生長的抑制情況，B為復(fù)合材料對金黃色葡萄球菌生長的抑制情況。圖中各紙片負(fù)載復(fù)合材料質(zhì)量均為0.1 mg，詳細(xì)情況見表2。

圖10 凍干粉抑菌性能

觀察兩種細(xì)菌生長情況，由圖10A可知，負(fù)載材料的各紙片邊緣處均出現(xiàn)環(huán)狀抑菌圈，且抑菌環(huán)的寬度(抑菌圈半徑與紙片半徑之差)從1～5逐漸減小，6處抑菌環(huán)寬度與3處大致相同；與A類似，B中抑菌環(huán)同樣從1～5依次減小，6處抑菌環(huán)寬度與3處大致相同。使用游標(biāo)卡尺量取各個抑菌環(huán)寬度，結(jié)果見表2。

表2 凍干粉抑菌環(huán)寬度

由表2可知，整體來看，復(fù)合材料對大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于對金黃色葡萄球菌，且在較高濃度下，復(fù)合材料對兩種細(xì)菌的抑制作用相差不大，較低濃度時，差異明細(xì)。此外，復(fù)合材料的抑菌性隨著N-烷基化殼聚糖的含量增加而增強(qiáng)。與大腸桿菌相比，復(fù)合材料對金黃色葡萄球菌的抑菌性受N-烷基化殼聚糖的負(fù)載量影響較大。復(fù)合材料具有與殼聚糖相當(dāng)?shù)囊志?，可為接觸部位持續(xù)提供無菌環(huán)境，可有效避免創(chuàng)面的感染，有利于傷口愈合。

3 結(jié)論

以N-CTS、Bsp為原料，通過離子交聯(lián)法制備了不同Bsp含量的N-CTS/Bsp復(fù)合凍干粉，理化表征及性能表明，Bsp負(fù)載量與投料量呈正相關(guān)，凍干粉呈三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，吸水性較強(qiáng)，從側(cè)面顯示出其較強(qiáng)的血液吸收能力，降解速率隨著Bsp比例的增加而加快，抑菌性良好，且抑菌性隨著N-CTS比例增加而增強(qiáng)。綜合考慮各指標(biāo)，確定凍干粉最佳制備條件為：N-烷基化殼聚糖與白芨多糖比例為4∶1，原料總濃度為2 g/L，N-CTS與交聯(lián)劑的正負(fù)電荷比為20∶1。在此條件下制備的復(fù)合凍干粉具有較高產(chǎn)率89%，良好的吸水性能327%，適宜的降解速率，4周降解59.4%，粒徑分布均勻，平均粒徑 14.79 μm，與血小板大小相近，且N-烷基化殼聚糖占比較高，具備良好的抑菌性，具備作為止血材料使用的巨大潛力。