趙冬敏，黃欣梅，章麗嬌，劉青濤，楊婧，韓凱凱，劉宇卓，李銀

坦布蘇病毒感染誘導(dǎo)雛鴨體內(nèi)未折疊蛋白反應(yīng)

趙冬敏，黃欣梅，章麗嬌，劉青濤，楊婧，韓凱凱，劉宇卓，李銀

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，南京 210014

【】檢測坦布蘇病毒在雛鴨體內(nèi)誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)的信號通路（PERK、IRE1和ATF6），為揭示坦布蘇病毒致病機制提供理論基礎(chǔ)。取1日齡SPF雛鴨，腹腔接種坦布蘇病毒（JS804株），于接種后12、24、36和48 h從對照組和攻毒組各取5只剖殺，分別取肝臟、心臟和腦組織，利用組織總RNA提取試劑盒提取各個組織樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)未折疊蛋白反應(yīng)的3條信號通路，選取不同通路中的標(biāo)志性分子，設(shè)計合成特異性引物，利用熒光定量PCR方法檢測靶基因。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用相對定量法（2-ΔΔCt），分析靶基因的表達水平。雛鴨肝臟中坦布蘇病毒含量最高，心臟次之，腦最低。對未折疊蛋白反應(yīng)標(biāo)志性分子GRP78的檢測結(jié)果顯示，腦和肝臟中GRP78表達量持續(xù)升高，并在攻毒后36 h達到頂峰（4.21倍和10.14倍），心臟中GRP78表達量僅在攻毒后36 h短暫升高（1.32倍）。PERK信號通路標(biāo)志性分子ATF4表達水平在肝臟和腦中分別從攻毒后24 h和36 h持續(xù)升高至攻毒后48 h，并在攻毒后36 h達到頂峰（2.71倍和6.02倍），心臟中ATF4的表達量則僅在攻毒后36 h時升高（1.57倍）。IRE1信號通路標(biāo)志性分子XBP1s在肝臟中的表達量升高最為顯著（9倍），而腦中EDEM的表達量升高最為顯著（3.87倍）且持續(xù)時間最長（從攻毒后12 h至攻毒后48 h）。與對照組相比，ATF6信號通路標(biāo)志性分子GRP94和XBP1u均出現(xiàn)升高現(xiàn)象，雖然兩種蛋白在不同組織中表達量變化的時間點和趨勢不同，但均在攻毒后36 h出現(xiàn)峰值。首次報道了坦布蘇病毒感染可在雛鴨體內(nèi)激活未折疊蛋白反應(yīng)的3條信號通路，本研究將有助于深入研究坦布蘇病毒與宿主之間的相互作用機制。

坦布蘇病毒；SPF雛鴨；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；未折疊蛋白反應(yīng)；信號通路

0 引言

【研究意義】內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是病毒蛋白折疊、裝配與成熟的場所，病毒蛋白的大量合成常導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。發(fā)生應(yīng)激后，為了維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和功能，細胞隨即啟動未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）應(yīng)對病毒感染導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。UPR不僅可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，還可調(diào)控細胞自噬與凋亡，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號通路，抑制干擾素等天然抗病分子的表達，參與病毒致病過程[1]。因此，對UPR進行深入研究有助于闡明病毒的致病機制。坦布蘇病毒（tembusu virus，TMUV）是一種危害鴨鵝的黃病毒屬病毒，主要引起患病鴨鵝食欲急劇減退、產(chǎn)蛋量驟降、癱瘓及出血性卵巢炎，給鴨鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失[2]。作為一種新發(fā)病原，TMUV的致病機制尚不明確。鑒于UPR在病毒感染及致病機制中的重要作用，本文針對TMUV感染后誘導(dǎo)雛鴨體內(nèi)UPR進行探討，不僅加深對TMUV致病機制的認識，也有利于TMUV感染的綜合防控?！厩叭搜芯窟M展】坦布蘇病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬，病毒基因組為單股正鏈RNA，大小約為11 kb，可以直接作為mRNA翻譯3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。黃病毒屬病毒在細胞中復(fù)制的典型結(jié)構(gòu)特征是病毒復(fù)制發(fā)生在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，感染后病毒對宿主細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行重塑[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中一種重要的細胞器，具有多種生物學(xué)功能，如鈣離子的儲存、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜和分泌型蛋白的合成和折疊等，接近三分之一的分泌型蛋白是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊和成熟的[4-5]。為了保證分泌蛋白可以正確折疊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有一套嚴(yán)謹(jǐn)和復(fù)雜的質(zhì)量控制系統(tǒng)，如果錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中大量聚集則會影響其正常生理功能，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。為了恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細胞會啟動未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。UPR可通過抑制新生蛋白的合成、降解駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的病毒蛋白量或誘導(dǎo)促折疊伴侶分子表達等增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[7]。UPR主要包括3條信號通路，分別由3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白起始：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、I型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜蛋白激酶（IRE1）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）[8]。在PERK信號通路中，真核翻譯起始因子2的α亞基（eIF2α）被磷酸化后，抑制eIF2α啟動的mRNA翻譯，減少蛋白質(zhì)合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負擔(dān)。同時磷酸化的eIF2α上調(diào)激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的表達，ATF4可依次上調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα-同源蛋白（CHOP，也稱GADD153）和生長抑制DNA損傷基因34（GADD34）的表達。GADD34可與蛋白磷酸酶1（PP1）結(jié)合，水解eIF2αSer51位的磷酸基團，發(fā)揮反饋抑制作用，部分恢復(fù)蛋白的翻譯[9-10]。在IRE1信號通路中，具有轉(zhuǎn)錄因子活性的剪切型X盒結(jié)合蛋白1（XBP1s）可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白（EDEM）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑（ERAD）中分子伴侶的表達，促進錯誤折疊蛋白的降解[11-12]。在ATF6信號通路中，ATF6被水解后釋放出含有b-ZIP的轉(zhuǎn)錄激活功能域（ATF6p50），轉(zhuǎn)位入核后，作為轉(zhuǎn)錄因子，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)元件（ERSE）結(jié)合，編碼產(chǎn)生更多的分子伴侶，如GRP78、GRP94和蛋白二硫異構(gòu)酶（PDI），提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的能力[13-14]。目前，很多研究報道黃病毒屬病毒感染后可誘導(dǎo)UPR。登革病毒（DENV）感染后誘導(dǎo)的UPR途徑具有時間依賴性：感染早期主要誘導(dǎo)PERK途徑，隨后該途徑關(guān)閉，在感染的中晚期IRE1途徑和ATF6途徑依次開啟[15]。西尼羅病毒（WNV）減毒株感染后可抑制PERK信號通路的開啟，而具有神經(jīng)毒力的強毒株感染誘導(dǎo)的UPR可開啟3條信號通路[16-17]。日本乙型腦炎病毒（JEV）感染其易感細胞后可促進分子伴侶的表達[18]。此外，導(dǎo)致新生兒小頭畸形和成人神經(jīng)發(fā)育異常的寨卡病毒（ZIKV）可在體內(nèi)、體外激活I(lǐng)RE1信號通路和ATF6信號通路，緩解ZIKV感染導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[19]?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關(guān)TMUV感染誘導(dǎo)UPR的研究較少，Zhao等[3]的研究表明TMUV感染BHK-21細胞后，可在不同時期誘導(dǎo)細胞啟動不同的UPR信號通路，但是尚無TMUV感染后在體內(nèi)誘導(dǎo)UPR信號通路的相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了進一步研究TMUV感染后在雛鴨體內(nèi)誘導(dǎo)的UPR信號通路，本文通過檢測UPR不同信號通路中的靶分子表達水平，分析TMUV感染在雛鴨體內(nèi)誘導(dǎo)的UPR，拓展對TMUV感染誘導(dǎo)UPR的認識，為闡明TMUV致病機理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

坦布蘇病毒JS804株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病與生物獸藥研究室保存；SPF鴨胚購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，自行孵化至出殼，置于隔離器中飼養(yǎng)。組織總RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、2×ChamQ SYBR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雛鴨攻毒試驗 40只1日齡SPF雛鴨隨機分為2組，分別為攻毒組和對照組，每組20只。攻毒組腹腔接種104TCID50TMUV JS804株病毒液，對照組僅接種相同體積的RPMI-1640培養(yǎng)液。將攻毒組和對照組隔離飼養(yǎng)，于攻毒后12、24、36和48 h，每組隨機抽取5只剖殺，分別取肝臟、心臟和腦組織，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 將每只雛鴨肝臟、心臟和腦分別用組織勻漿機處理，分別取0.1 g處理后的組織勻漿，加入0.2 mL Trizol，按照組織總RNA提取試劑盒的操作步驟提取組織總RNA。紫外分光光度計測定RNA濃度后，取1 μg RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計 選取UPR三條信號通路中的靶分子，設(shè)計SYBR Green I熒光定量PCR引物（表1），交由南京金斯瑞生物有限公司合成。

1.2.4 SYBR Green I熒光定量PCR檢測不同組織中TMUV核酸拷貝數(shù) 將含有E基因片段的質(zhì)粒pMD18- E在大腸桿菌DH5α中擴增，提取質(zhì)粒，用Nanodrop2000分光光度計測定其濃度。根據(jù)質(zhì)粒濃度和分子量，計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)。對已知含量的質(zhì)粒進行10倍系列稀釋，取1 μL作為陽性模板。用針對E基因的特異性引物（表1）對不同稀釋度的質(zhì)粒進行 SYBR Green I熒光定量PCR擴增。SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)體系總計20 μL，包括2×ChamQ SYBR Master Mix 10 μL，上下游引物（25μmol·L-1）各0.56 μL，陽性模板1 μL，ddH2O 7.88 μL。反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃ 10 s，60℃ 30 s（此階段收集熒光信號），共40個循環(huán)。以ddH2O為模板作為空白對照。采集熒光數(shù)據(jù)，繪制E基因拷貝數(shù)和Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將反轉(zhuǎn)錄獲得的不同組織cDNA用Nanodrop2000分光光度計進行濃度測定，用ddH2O調(diào)整至100 ng·μL-1。以組織cDNA為模板，用針對E基因的特異性引物進行 SYBR Green I熒光定量PCR檢測。SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)體系總計20 μL，包括2×ChamQ SYBR Master Mix 10 μL，上下游引物（25 μmol·L-1）各0.56 μL，cDNA模板1 μL（100ng），ddH2O 7.88 μL。反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃ 10 s，60℃ 30 s（此階段收集熒光信號），共40個循環(huán)。以ddH2O為模板作為空白對照。采集熒光數(shù)據(jù)，將不同組織的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算不同組織中病毒的拷貝數(shù)。

1.2.5 SYBR Green I熒光定量PCR檢測UPR靶分子 將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用Nanodrop2000分光光度計進行濃度測定，用ddH2O調(diào)整至100 ng·μL-1。SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)體系總計20 μL，包括2×ChamQ SYBR Master Mix 10 μL，上下游引物（25 μmol·L-1）各0.56 μL，cDNA模板1 μL（100 ng），ddH2O 7.88 μL。反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃ 10 s，60℃ 30 s（此階段收集熒光信號），共40個循環(huán)。以ddH2O為模板作為空白對照。采集熒光數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析采用相對定量法（2-ΔΔCt），以GAPDH為內(nèi)參基因，分別計算攻毒組和對照組樣品的循環(huán)閾值差值：ΔCt靶基因=Ct靶基因－Ct內(nèi)參基因。以同一時間點對照組為對照，計算攻毒組靶基因的表達情況：ΔΔCt=攻毒組ΔCt靶基因－對照組ΔCt靶基因。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 不同組織中TMUV核酸的檢測

雛鴨攻毒后，于攻毒后第12、24、36、48小時分別檢測攻毒組和對照組不同組織中病毒核酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒后12 h至36 h期間各組織中TMUV含量顯著升高，在攻毒后36 h時3種臟器中TMUV核酸含量達到頂峰，腦、肝臟和心臟中TMUV核酸含量分別是攻毒后12 h時的105.66、104.94、105.9倍。在攻毒后48 h時3種臟器中TMUV核酸含量均稍有降低。比較3種臟器中TMUV核酸含量發(fā)現(xiàn)，肝臟中TMUV核酸含量最高，心臟次之，腦組織最低（圖1）。在整個檢測過程中，未從對照組組織中檢測到TMUV核酸。

2.2 TMUV感染誘導(dǎo)GRP78表達情況檢測

分子伴侶GRP78被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR的標(biāo)志性分子，GRP78表達量升高說明存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，UPR被激活。為了確定TMUV感染雛鴨后是否在體內(nèi)激活UPR，在攻毒后第12、24、36、48小時分別檢測攻毒組和對照組雛鴨不同組織中GRP78的表達情況。與對照組相比，腦組織中GRP78表達量在攻毒后12 h開始升高，并持續(xù)至攻毒后48 h。肝臟中GRP78表達量在攻毒后24 h升高，在攻毒后36 h達到頂峰（10.14倍），隨后有所降低（5.33倍）。心臟中GRP78表達量僅在攻毒后36 h略有升高（1.32倍），其他時間點則未檢測到GRP78表達量升高（圖2）。上述結(jié)果說明，TMUV感染在雛鴨體內(nèi)激活了UPR。

圖1 不同組織中TMUV核酸的拷貝數(shù)

2.3 TMUV感染誘導(dǎo)PERK信號通路的檢測

PERK信號通路開啟后，磷酸化的eIF2α?xí)?yōu)先起始ATF4 mRNA的翻譯，因此，ATF4的表達水平可以反映UPR中PERK途徑是否開啟。與對照組相比，ATF4表達水平最先在肝臟中顯著升高，從TMUV攻毒后24 h持續(xù)至攻毒后48 h。腦組織中ATF4的表達在攻毒后36 h開始顯著升高并持續(xù)至48 h，而心臟中ATF4的表達則僅在攻毒后36 h時升高（1.57倍）。腦、肝臟和心臟中ATF4表達量的峰值均出現(xiàn)在攻毒后36 h（2.71倍、6.02倍、1.57倍）。上述結(jié)果顯示，TMUV感染后可誘導(dǎo)PERK信號通路，但是不同臟器中開啟該信號通路的時間不同（圖3）。

圖2 不同組織中GRP78表達量的檢測

2.4 TMUV感染誘導(dǎo)IRE1信號通路的檢測

IRE1信號通路中，IRE1通過自身磷酸化作用激活其核糖核酸酶活性，剪切唯一底物XBP1mRNA，造成移碼突變，編碼新型XBP1蛋白，即剪切型XBP1（XBP1s）。XBP1s具有轉(zhuǎn)錄因子活性，可誘導(dǎo)EDEM等UPR相關(guān)靶基因表達。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，TMUV感染后，攻毒組雛鴨腦、肝臟和心臟中XBP1s的表達量在攻毒后36 h達到峰值，隨后開始降低，但仍顯著高于對照組雛鴨的表達量，其中肝臟中XBP1s的表達量在3種臟器中升高最為顯著（9倍）。與XBP1s不同的是，腦中EDEM的表達量最高，持續(xù)時間最長，說明TMUV感染能在腦中持續(xù)激活EDEM的表達。上述結(jié)果顯示，TMUV感染后可誘導(dǎo)IRE1信號通路（圖4）。

圖3 不同組織中ATF4表達量的檢測

2.5 TMUV感染誘導(dǎo)ATF6信號通路的檢測

ATF6信號通路中，活化的ATF6可促進下游靶基因的表達。為了確定TMUV感染是否激活A(yù)TF6信號通路，分別檢測了ATF6靶基因GRP94和非剪切型XBP1（XBP1u）的表達情況。如圖5所示，與對照組相比，GRP94和XBP1u表達均出現(xiàn)升高現(xiàn)象，說明TMUV感染激活了ATF6信號通路，但不同組織中兩者表達量變化的趨勢和時間點存在不同。在腦組織中，TMUV感染未導(dǎo)致GRP94表達量發(fā)生大幅度變化，僅在攻毒后36 h略有升高（1.26倍）；XBP1u則在攻毒后12 h出現(xiàn)升高并持續(xù)至攻毒后48 h（1.49、1.07、1.73和1.57倍）。在肝臟中，GRP94和XBP1u表達量變化的趨勢一致，在攻毒后24 h開始上升，至攻毒后36 h出現(xiàn)峰值（4.93倍、4.73倍），隨后略有降低，但仍顯著高于對照組（2.83倍、3.14倍）。在心臟中，TMUV攻毒后48 h內(nèi)僅在攻毒后36 h時檢測到GRP94和XBP1u的表達量出現(xiàn)升高（1.26和1.39倍）。

圖4 不同組織中XBP1s、EDEM表達量的檢測

圖5 不同組織中GRP94、XBP1u表達量的檢測

3 討論

病毒利用宿主資源促進其復(fù)制繁殖[20]。在這一過程中會在宿主細胞內(nèi)合成大量病毒蛋白，造成未折疊蛋白或者錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量聚集，最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。為了緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，宿主通過激活3種感應(yīng)器蛋白（PERK、IRE1和ATF6）提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力，促進錯誤折疊蛋白的降解，這一應(yīng)對機制被稱為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）[21]。UPR廣泛存在于不同病毒感染的細胞中，如雞馬立克氏病毒、乙型肝炎病毒、皰疹病毒、流感病毒、豬圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒及黃病毒屬病毒等[22-26]。

黃病毒屬病毒的病毒粒子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔組裝和成熟[27]。研究表明，多種黃病毒屬病毒，包括JEV、DENV、WNV和TBEV通過激活UPR緩解由病毒蛋白大量累積造成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11, 16, 28-29]。但是，目前尚未見TMUV感染后在宿主體內(nèi)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR激活的報道。

本課題組的前期研究及其它研究均表明，TMUV在體內(nèi)和體外感染宿主后迅速開始復(fù)制繁殖，病毒滴度在感染后48 h內(nèi)處于指數(shù)增長期[30-31]。由于病毒蛋白大量聚集是UPR的誘因，因此本研究在TMUV攻毒后48 h內(nèi)對UPR進行了檢測。鑒于其他黃病毒屬病毒UPR的研究[16-19]及TMUV體外誘導(dǎo)UPR的研究[3]均在接毒后每隔12 h采樣檢測，因此本研究選取TMUV攻毒后12、24、36和48 h進行采樣。由于缺少針對鴨源UPR靶分子的特異性抗體，本研究利用熒光定量PCR方法對雛鴨感染TMUV后不同組織中UPR信號通路進行了研究。

臨床上患病鴨剖檢?？梢娔X膜充血、出血，心肌水腫、松軟，肝臟腫大，卵巢出血。人工攻毒試驗中，病毒雖然廣泛存在于各個臟器中，但是由于攻毒毒株不同、鴨的品種不同、攻毒日齡和途徑不同、病毒檢測的時間點不同，導(dǎo)致不同研究中病毒分布檢測結(jié)果并不一致[30, 32-33]。綜合臨床患病鴨剖檢結(jié)果和其它研究中人工攻毒試驗結(jié)果，本研究檢測了攻毒雛鴨腦、肝臟、心臟的病毒滴度和UPR。結(jié)果顯示，TMUV感染雛鴨后，組織中病毒的含量在攻毒后36 h最高，其中肝臟中的病毒含量最高。雖然腦中病毒滴度在3種臟器中最低，但是在攻毒后36 h病毒拷貝數(shù)仍可達107.9，說明TMUV可在雛鴨腦內(nèi)進行有效復(fù)制，這與臨床上TMUV感染后常常導(dǎo)致癱瘓及腦炎樣神經(jīng)癥狀相符。

GRP78被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR的標(biāo)志分子。正常狀態(tài)時GRP78作為分子伴侶與PERK、IRE1和ATF6結(jié)合，使這些分子不能活化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時GRP78與這些感應(yīng)分子解離，使感應(yīng)分子活化，啟動從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細胞核的信號級聯(lián)放大效應(yīng)，引發(fā)UPR[34]。GRP78的檢測結(jié)果顯示，雖然不同臟器GRP78表達量開始升高的時間點不盡相同，但是都在攻毒后36 h到達頂峰，以肝臟中GRP78表達量的變化最為顯著（升高約10.14倍）。這些結(jié)果顯示隨著TMUV在組織內(nèi)復(fù)制繁殖，合成大量病毒蛋白，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活UPR。

PERK信號通路主要通過降低宿主翻譯水平，抑制新生蛋白合成，來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。本研究通過檢測ATF表達水平反應(yīng)PERK信號通路狀態(tài)。在3種臟器中，TMUV攻毒后24 h肝臟最先激活PERK信號通路，腦中PERK信號通路在攻毒后36 h激活，兩種臟器中PERK信號通路均可持續(xù)至攻毒后48 h，而心臟中PERK信號通路僅在攻毒后36 h時短暫開啟，說明PERK信號通路可能不是心臟中UPR的主要信號通路。IRE信號通路主要通過降解錯誤折疊蛋白的方式恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[11]。TMUV感染后，IRE1信號通路標(biāo)志性分子sXBP1和EDEM表達水平都在攻毒后36 h達到峰值。腦的檢測結(jié)果說明IRE1信號通路可能是TMUV感染后腦中UPR的主要信號通路。ATF6信號通路通過促進分子伴侶的表達提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的能力[7]。Zhao等報道BHK-21細胞感染TMUV后12 h至24 h短暫激活A(yù)TF6信號通路，但是該通路并不是TMUV激活的UPR的主要信號通路。然而，本研究的體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，ATF6信號通路從攻毒后24 h至攻毒后48 h持續(xù)激活，該通路標(biāo)志性分子GRP94和XBP1u的表達量變化趨勢說明ATF6是肝臟中UPR的主要信號通路之一，這些差異表明TMUV感染激活UPR信號通路在體內(nèi)和體外存在不同。

病毒感染激活UPR的同時，也可利用UPR促進其自身復(fù)制繁殖并實現(xiàn)在細胞中的持續(xù)感染[35]。Ambrose等[36]報道WNVKUN感染ATF6缺失細胞后，eIF2α磷酸化水平升高，病毒蛋白合成和感染性病毒粒子釋放均顯著下降。Yu等[37]報道激活I(lǐng)RE1信號通路可抑制細胞凋亡，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進病毒蛋白合成。He等[38]報道豬瘟病毒感染導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活I(lǐng)RE1-XBP1-GRP78信號通路促進病毒復(fù)制。WNV和DENV通過激活A(yù)TF6信號通路調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和固有免疫應(yīng)答促進病毒復(fù)制[36, 39]。這些研究表明，UPR在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是UPR在TMUV復(fù)制過程中作用的研究尚處于空白，有待后續(xù)研究。

4 結(jié)論

坦布蘇病毒感染雛鴨24 h時在腦、肝臟、心臟中激活PERK、IRE1和ATF6信號通路，在感染后36 h達到高峰。肝臟中病毒含量最高，3條信號通路均被顯著激活；心臟中病毒含量低于肝臟中病毒含量，其主要激活I(lǐng)RE1通路，PERK和ATF6通路僅在感染后36 h短暫激活；腦中主要激活PERK和IRE1通路，ATF6可被短暫激活但不作為主要通路。

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The Induction of Unfolded Protein Response in Tembusu Virus Infected Ducklings

ZHAO DongMin, HUANG XinMei, ZHANG LiJiao, LIU QingTao, YANG Jing, HAN KaiKai, LIU YuZhuo, LI Yin

Institute of Veterinary Science, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biologicals Engineering and Technology, Ministry of Agriculture/National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products, Nanjing 210014

【】The aim of this study was to determine the signal pathways (PERK, IRE1 and ATF6) of unfolded protein response induced by tembusu virus in ducklings, so as to provide a theoretical basis for elucidating the pathogenesis of TMUV.1-day-old SPF ducklings were infected intraperitoneally with TMUV (JS804). Ducklings inoculated in the same manner with equal volume of RMPI-1640 were used as negative control. Five ducklings from each group were euthanized at 12, 24, 36 h and 48 h post infection, and their brains, livers and hearts were collected. The total RNAs were extracted from collected tissues by using total RNA extraction kit. Then the total RNAs were reverse transcribed into cDNA. Specific target genes representing the three known pathways of unfolded protein response were selected, and the primers were designed based on the published GenBank sequence. The relative expression of target genes was quantified by real time PCR. Real time PCR data were analyzed using the comparative Ct method (2-ΔΔCt). GAPDH was chosen as a reference gene for internal control. 【】 In three organs from infected ducklings, it was observed that the viral titers were the highest in the liver, lower in the heart, and the lowest in the brain. The unfolded protein response was characterized by upregulated expression of GRP78. The relative expression of GRP78 in the brain and liver were persistently upregulated and reached a peak at 36 h post infection (4.21 fold and 10.14 fold, respectively). GRP78 expression in the heart was upregulated transiently at 36 h post infection (1.32 fold). ATF4 expression represented the activation of PERK pathway. The ATF4 expression in the liver and brain were persistently upregulated from 24 h and 36 h post infection to 48 h post infection respectively, and peaked at 36 h post infection (2.71 fold and 6.02 fold, respectively). However, the upregulation of ATF4 expression in the heart was observed at 36 h post infection (1.57 fold). The activation of IRE pathway was characterized by XBP1s. In the liver, the expression level of XBP1s increased most significantly (9 fold). In the brain, the expression level of EDEM enhanced most significantly (3.87 fold) and persistently upregulated from 12 to 48 h post infection. Comparing to negative control, the expression of ATF6 pathway marker GRP94 and XBP1u were upregulated in three tissues, which reached a peaked at 36 h post infection, although expression profiles of GRP94 and XBP1u were different at indicated time points. 【】 It was the first report that TMUV infection induced three branches of unfolded protein response in ducklings, and these results might be helpful for understanding the interaction between tembusu virus infection and host response.

Tembusu virus; SPF ducklings; endoplasmic reticulum; unfolded protein response; signaling pathway

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.04.016

2020-03-17；

2020-07-10

國家自然科學(xué)基金（31802222）、國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0500804）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX（18）3017）

趙冬敏，Tel：025-84390047；E-mail：zhaodongmin126@126.com。通信作者李銀，Tel：025-84391687；E-mail：muziyin08@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）