閆多子，蔡霓，王峰，農(nóng)向群，王廣君，涂雄兵，張澤華

綠僵菌黏附素MAD1體外表達及誘導花生響應的作用

閆多子，蔡霓，王峰，農(nóng)向群，王廣君，涂雄兵，張澤華

中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193

【】綠僵菌具有昆蟲致病性和植物共生性，其黏附素MAD1在綠僵菌侵染寄主昆蟲過程中起重要作用。通過體外真核表達MAD1蛋白，明確MAD1在綠僵菌與植物共生中發(fā)揮的作用。以綠僵菌轉(zhuǎn)錄組的Unigenes作為參考序列，在GenBank中進行同源性檢索比對，設計引物，以金龜子綠僵菌（）IPPM010202菌株的cDNA作為模板，克隆得到，通過DNAMAN對序列進行蛋白翻譯，利用ProtParam在線工具預測MAD1蛋白氨基酸組成及其理化特性，利用SMART在線程序分析其結(jié)構域。構建重組真核表達載體并轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得重組子，通過甲醇誘導表達得到MAD1蛋白；通過Ni-NTA親和層析獲得純化蛋白。以純化蛋白溶液（20 μg·mL-1）浸沒處理花生根0.5、6、12和24 h，通過qPCR檢測花生根膜受體基因（、）、免疫相關級聯(lián)基因（、、）和轉(zhuǎn)錄因子基因（）、細胞壁整合基因（）及防御相關基因（、）的轉(zhuǎn)錄水平?？寺〉玫搅司G僵菌黏附素基因，全長2 136 bp，編碼711個氨基酸，分子量約為74.8 kD；生物信息學分析表明，MAD1的N端有信號肽，C端有糖基磷脂酰肌醇（GPI）細胞壁錨定位點，且含有CFEM功能結(jié)構域，屬于親水性蛋白。成功構建了MAD1真核表達系統(tǒng)，誘導表達并純化出具有生物活性的MAD1蛋白，對花生根進行不同時間段的處理，發(fā)現(xiàn)MAD1處理后0.5 h，根尖細胞感知并啟動膜類識別受體基因表達；0.5—6 h，根膜受體基因轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)，膜整合基因轉(zhuǎn)錄由下調(diào)轉(zhuǎn)為上調(diào)，免疫反應相關基因、、、的轉(zhuǎn)錄受到短暫抑制，防御基因、轉(zhuǎn)錄下調(diào)，植物根部免疫防御反應受到抑制；6—12 h，膜受體基因維持上調(diào)表達，而防御基因從下調(diào)逆轉(zhuǎn)為強烈上調(diào)；12—24 h，膜受體類基因、，防御基因、均上調(diào)，免疫相關級聯(lián)基因、、，轉(zhuǎn)錄因子基因也出現(xiàn)微弱的上調(diào)，植物根部啟動免疫防御反應。在綠僵菌與花生根的互作早期，綠僵菌MAD1蛋白 6 h時已激活花生根膜受體基因和的識別響應，同時抑制花生免疫級聯(lián)基因、、及防御相關基因如、的表達，有助于綠僵菌在花生根組織上定殖；隨后誘導花生細胞壁整合基因上調(diào)表達，參與根上受損細胞壁的修復與重建，促進綠僵菌與花生共生關系的建立。誘導植物的免疫抑制和細胞壁重建整合可能是綠僵菌與植物建立共生關系的重要步驟。

MAD1；金龜子綠僵菌；共生；植物免疫；防御；真核表達

0 引言

【研究意義】綠僵菌經(jīng)過漫長的演化過程，形成了兼?zhèn)涓?、植物共生、昆蟲致病的生活能力，以適應各種環(huán)境[1]。由于具有廣泛的昆蟲寄主和高效致病力，已被研究用于防治幾十種農(nóng)林害蟲[2]，并作為昆蟲病原真菌的模式菌用于研究對昆蟲的侵染過程和致病機理。MAD1作為綠僵菌黏附及毒力的調(diào)節(jié)蛋白，參與綠僵菌與昆蟲寄主的互作，但綠僵菌與植物的互作機制極少報道。研究MAD1誘導植物響應對調(diào)控綠僵菌與植物的互作具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】綠僵菌侵染昆蟲寄主首先是在表皮上附著、定殖，然后穿透表皮進入體內(nèi)[3]。已有研究表明，綠僵菌在附著昆蟲體表時產(chǎn)生黏附蛋白MAD1，促進真菌孢子穩(wěn)定地吸附，有助于形成的附著胞“釘”入宿主體表，對成功侵入寄主起關鍵作用。當缺失后，綠僵菌分生孢子對寄主體表的黏附能力與毒力均顯著降低[4-6]。用體外表達的MAD1蛋白與麥麩做成餌劑飼喂蝗蟲，處理后24 h檢測發(fā)現(xiàn)，蝗蟲中腸的過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性受到抑制，表明MAD1對蝗蟲的免疫有一定的抑制作用[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，綠僵菌能夠在植物根際和進入植物體內(nèi)宿存，且促進植物生長。例如，用綠僵菌分生孢子處理柳枝稷（）和菜豆（）后，可促進根毛及其側(cè)根生長[8]。綠僵菌孢子懸浮液處理番茄（）種子后，種植的番茄株高、根長、側(cè)根數(shù)量以及根干重均比對照明顯增加[9]。另外，綠僵菌侵入植物根組織內(nèi)的現(xiàn)象也得到證實。以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的羅伯茨綠僵菌（）菌株接種菜豆幼苗60 d后，用共聚焦顯微鏡觀察到根表皮的綠色熒光菌絲；將菜豆根系組織制成切片，用溴酚藍染色法觀察到菌體在60 d內(nèi)穿透豆根細胞壁，侵入根細胞內(nèi)生長[8]。以增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）標記的金龜子綠僵菌（）接種玉米（）14 d后，通過定性和定量PCR從玉米根DNA中擴增到egfp片段，通過激光共聚焦（laser scanning confocal microscopy，LSCM）技術檢測到定殖于玉米根中帶綠色熒光的菌絲，證明綠僵菌可以定殖于玉米根部[10]。然而，有關綠僵菌作為植物內(nèi)生菌如何黏附、定殖于植物的過程和機理研究甚少，植物對綠僵菌誘導產(chǎn)生的分子生物學響應也極少報道。植物經(jīng)長期進化形成了應對微生物的免疫系統(tǒng)。位于細胞膜上的各類模式識別受體（pattern-recognition receptor，PRR）能夠感知微生物相關分子模式（microbe-associated molecular pattern，MAMP），激發(fā)病原因子觸發(fā)免疫反應（PAMP-triggered immunity，PTI），如活性氧（reactive oxygen species，ROS）的爆發(fā)、鈣離子（Ca2+）的流入、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活、防御基因表達的上調(diào)等[11]。微生物為了成功入侵宿主，又進化出效應蛋白來躲避或抑制植物免疫反應，以在植物體內(nèi)宿存和生長。而植物也進化出相應的抗病蛋白（R蛋白）來應對效應子，激活效應子觸發(fā)免疫反應（effector-triggered immunity，ETI），抵抗微生物入侵[12]。對于致病或有益的微生物，植物可啟動或保留一定的反應來抵抗或兼容[13-14]。有研究表明有益真菌木霉（sp.）在定殖擬南芥（）的過程中，是通過對植物免疫反應的短暫抑制來實現(xiàn)在根部的定殖[15]。根瘤菌會主動抑制宿主的免疫防御反應，使感染和共生得以建立[16]。【本研究切入點】前期對綠僵菌處理的花生（）根組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)花生的一些代謝途徑和免疫途徑基因出現(xiàn)顯著差異表達[17]。以綠僵菌可定殖植物為出發(fā)點，研究黏附素MAD1在介導綠僵菌黏附、定殖中作為分子信號誘導植物產(chǎn)生的分子生物學響應?！緮M解決的關鍵問題】克隆并進行體外真核表達，檢測花生免疫防御等相關基因?qū)Ρ磉_蛋白誘導的響應，明確MAD1蛋白在綠僵菌定殖植物過程中的作用，為闡述綠僵菌與植物共生關系建立的機制提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室完成。

1.1 生物材料

金龜子綠僵菌IPPM010202菌株由本實驗室分離鑒定，保存于馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSAY）中。PSAY為1 L水中含馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂18 g，酵母粉5 g。產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基為1 L水中含MgSO42 g，蔗糖20 g，酵母粉10 g，K2HPO45 g。

酵母培養(yǎng)基YPD為1 L水中含酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g。酵母表達培養(yǎng)基BMGY為1 L水中含酵母粉10 g，KH2PO411.8 g，蛋白胨20 g，甘油10 mL。酵母表達培養(yǎng)基BMMY為1 L水中含酵母粉10 g，KH2PO411.8 g，蛋白胨20 g，甲醇5 mL?；A葡萄糖培養(yǎng)基MD為1 L水中含酵母粉13.4 g，生物素0.4 mg，葡萄糖20 g。

大腸桿菌感受態(tài)DH5購自全式金生物技術有限公司。PMD19-T載體、Prime ScriptTM1st strand cDNA sythesis kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶I、I、I、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司。酵母表達載體pPIC9K、畢赤酵母宿主菌GS115購自蘇州泓迅生物科技有限公司。D-山梨醇、Biomed回收試劑盒購自北京威萊博生物技術有限公司。

供試花生為魯花11號品系，從農(nóng)資商店采購。

1.2 菌絲培養(yǎng)及總RNA提取

將綠僵菌孢子接種到產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基中，28℃ 160 r/min搖床培養(yǎng)60 h。培養(yǎng)液通過抽濾盡量去除水分，然后用TRIzol?分離試劑盒（Invitrogen）提取總RNA。用Prime ScriptTM1st strand cDNA sythesis kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，并用NanoPhotometer微量分光光度計（IMPLEN，德國）檢測濃度。

1.3 黏附素基因mad1的克隆

以綠僵菌轉(zhuǎn)錄組的Unigenes作為參考序列[17]，在GenBank中進行同源性檢索比對，找到的開放閱讀框（ORF），設計擴增全長特異性引物-F（5′-TG CCGAGAGGTGCTCAGCTATTC）和-R（5′-TAGC ACTGTTGTTTAACGGCCGAAG）。優(yōu)化后的PCR反應體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，-F 4 μL，-R 4 μL，cDNA 2 μL，補足ddH2O 至50 μL。PCR反應的溫度控制程序為94℃預變性5 min，隨后，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Biomed回收試劑盒進行純化回收。再連接到PMD19-T載體上，熱激轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌感受態(tài)DH5中。通過氨芐（Amp）抗性篩選陽性克隆，PCR檢驗后送至上海生工生物（北京）公司測序。

1.4 生物信息學分析

以DNAMAN對克隆得到的序列進行蛋白翻譯。使用在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/ protparam）預測蛋白氨基酸組成、分子量、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)和總平均親水性等性質(zhì)；利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線程序分析其結(jié)構域。

1.5 黏附素基因mad1的真核表達

1.5.1 真核表達載體構建與酵母轉(zhuǎn)化 利用表達載體pPIC9K中AOX1作為啟動子，在克隆的5′端增加限制性內(nèi)切酶位點I，在3′端增加his-tag、終止密碼子TGA和限制性內(nèi)切酶位點I，得到I--I序列，將I--I與載體pPIC9K在限制性內(nèi)切酶I和I作用下分別進行雙酶切，酶切后產(chǎn)物于16℃條件下過夜連接。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌感受態(tài)DH5中。通過Amp抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物（北京）公司測序，確定位置、方向、大小和讀碼框完全正確。用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（天漠生物）提取質(zhì)粒，pPIC9K-重組表達質(zhì)粒用I內(nèi)切酶線性化，用Biomed回收試劑盒進行純化回收。將線性化的質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中。涂布于MD平板，48 h后觀察并挑選菌落。

1.5.2 轉(zhuǎn)化子篩選 挑取MD平板上5個單克隆，接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)36 h。離心收集菌體，用TIANamp Yeast DNA Kit酵母基因組DNA提取試劑盒（天根公司）提取酵母基因組。從重組質(zhì)粒pPIC9K-上的5′端及接頭序列設計特異性引物cmad1-F（5′-ATGAAGTCTGCTCTTTCTGTTGT TGTTGCCGC-3′），以的3′端及外延15 bp設計反向引物cmad1-R（5′-GACCGGTCTTCTCGTGCGG CCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3′），進行PCR擴增驗證。PCR反應體系為2×Taq PCR Master Mix 25 μL，cmad1-F 4 μL，cmad1-R 4 μL，cDNA 2 μL，補足ddH2O至50 μL。溫度控制程序為94℃預變性5 min，隨后，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳，鑒定陽性克隆。

1.6 重組蛋白MAD1的誘導表達和純化

陽性克隆單菌落接種到含有100 mL BMGY培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28℃250 r/min培養(yǎng)16—20 h。8 000 r/min離心收集菌體，加1 mL BMMY培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)接到100 mL BMMY培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并間隔24 h向培養(yǎng)基中添加甲醇至終濃度1.0%，誘導培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)物經(jīng)離心分離，分別收集上清和沉淀，用10% SDS-PAGE檢測。

沉淀的菌體用緩沖液（20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl，pH 8.0）重懸，進行超聲波破碎。破碎后的菌體4℃下離心，收集上清液，用Ni-NTA鎳柱純化，得到MAD1蛋白，保存在緩沖液（20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl，pH 7.8）中備用。

1.7 表達蛋白誘導花生響應的作用分析

1.7.1 MAD1誘導處理 花生種植參照Miché等[18]的方法先用4%NaClO和15% H2O2溶液進行種子表面消毒，再將種子浸泡于含50 mL蒸餾水的15 cm×15 cm的培養(yǎng)皿中，黑暗培養(yǎng)箱中28℃催芽24 h，然后挑選萌芽健康一致的種子，播種到裝有已滅菌蛭石的花盆中，于培養(yǎng)室（L﹕D=14﹕10，28℃）培養(yǎng)14 d，相對濕度為40%—60%，生長至二葉期。

MAD1處理花生：將純化的MAD1蛋白用50 kD蛋白超濾管（Millipore）離心濃縮，更換緩沖液為ddH2O，配置成20 μg·mL-1的處理液。取上述生長一致的花生幼苗6株，每2株一組，將根部浸入20 mL的蛋白液中，3個重復處理，同時以ddH2O處理為對照。于28℃處理0.5、6、12、24 h，取出幼根，用吸水紙吸干，根部剪成5—8 mm，立即置于液氮中。同一處理不同的重復進行混樣后，分成3份，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 花生根實時熒光定量PCR檢測 取花生根樣品，置于液氮中研磨，然后用TRIzol?分離試劑盒（Invitrogen）提取總RNA。用Prime ScriptTM1st strand cDNA sythesis kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。并用NanoPhotometer微量分光光度計（IMPLEN，德國）檢測濃度。

采用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測不同處理的花生根組織中免疫防御相關基因轉(zhuǎn)錄水平。基于之前的轉(zhuǎn)錄組分析[17]確定候選基因，設計的引物序列見表1，內(nèi)參基因用60s ribosomal protein L7（）。用SYBR Green熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）在7500型（ABI公司）實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行反應。反應體系為SYBR Green preMix 10 μL，正反向引物各2 μL，cDNA 1 μL，補足ddH2O至20 μL。PCR擴增程序為95℃預變性3 min，95℃變性15 s，60℃復性1 min，40個循環(huán)。每樣品3次技術重復，基因相對表達量采用2-ΔΔCt[19]的方法進行分析。

qPCR檢測每個樣品的3次技術重復。以Student’s-test（＜0.05）（SPSS version 16.0）方法分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學顯著性差異，所有試驗相同處理不同重復的數(shù)據(jù)采用均值±標準誤（standard error，SE）表示。

表1 候選基因及其特異性引物

2 結(jié)果

2.1 黏附素基因mad1的克隆和生物信息學分析

用所設計的特異性引物，從金龜子綠僵菌IPPM010202菌株cDNA擴增得到了預期長度的擴增片段（圖1）。經(jīng)測序，該片段包含的完整開放閱讀框（ORF），全長為2 136 bp（GenBank序列號MT375602）。該基因編碼711個氨基酸，該蛋白的理論分子量為74.8 kD，預測等電點pI為6.28。在20種氨基酸中，蘇氨酸（Thr）所占比例最高（12.0%），甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）所占的比例最低（0.7%）；含51個負電荷氨基酸殘基，48個正電荷氨基酸殘基；不穩(wěn)定指數(shù)為44.66，屬于不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性-0.414，屬于親水性蛋白。經(jīng)二級結(jié)構分析，MAD1在N端有信號肽，在C端有預測的糖基磷脂酰肌醇（GPI）細胞壁錨定位點，在中間區(qū)域包含蘇氨酸（Thr）的串聯(lián)重復序列。在末端區(qū)域含脯氨酸（Pro）串聯(lián)重復序列。另外，MAD1結(jié)構中有一個含有8個半胱氨酸的CFEM功能結(jié)構域，含這種結(jié)構域的蛋白可以作為細胞表面受體、信號轉(zhuǎn)導者或與宿主相互作用的黏附分子（圖2）。

M：DL5000 DNA marker；1：ddH2O；2：綠僵菌cDNA cDNA from M. anisopliae

圖2 綠僵菌黏附素MAD1結(jié)構

2.2 重組表達質(zhì)粒和酵母重組子的鑒定

將構建到表達載體pPIC9K上，獲得了重組質(zhì)粒，經(jīng)I和I雙酶切，電泳檢測到預期大小一致的片段。將陽性重組質(zhì)粒送檢測序，結(jié)果證明的插入位置、方向、大小和讀碼框均正確，表明重組表達載體構建成功。轉(zhuǎn)入宿主畢赤酵母GS115后，挑選單克隆，以cmad1-F、cmad1-R為引物進行PCR檢測，結(jié)果均在預期的2 136 bp附近得到單一條帶（圖 3），表明已將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主畢赤酵母中。

2.3 誘導表達產(chǎn)物的檢驗

含有的重組酵母菌株經(jīng)甲醇誘導表達，分別對發(fā)酵液和菌體蛋白進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，發(fā)酵液上清中未檢測到目的蛋白（圖4-A）。發(fā)酵液沉淀的菌體經(jīng)超聲波破碎后，上清中檢測到目的蛋白（圖4-B），經(jīng)鎳柱純化后SDS-PAGE檢測，在20 mmol·L-1咪唑洗脫液中獲得大量蛋白，符合預期分子量74.8 kD（圖4-C），表明在畢赤酵母中成功表達。

M：DL 5000 DNA marker；N：空載酵母GS115 Empty carrier yeast GS115；1—5：重組單克隆Recombinant clones

A：發(fā)酵液上清supernatant of fermentation broth；B：菌體破碎提取上清extract of crushed cell；C：MAD1蛋白純化Purification of MAD1 protein

2.4 黏附素MAD1誘導花生響應的作用分析

以重組酵母表達的MAD1處理花生幼苗根部，檢測了在處理0.5、6、12、24 h的4個時間段內(nèi)花生根組織9個免疫防御相關基因的相對表達量變化。結(jié)果如圖5所示，在與MAD1互作初期的0.5 h內(nèi)，花生根膜受體基因已經(jīng)啟動，表達量顯著高于對照，至6 h時繼續(xù)上升至對照的2.5倍，之后有所波動，一直保持顯著高于對照的水平。另一膜受體基因的表達是0.5 h內(nèi)先略受抑制，然后迅速上升，6—12 h時達到對照的1.69倍左右，24 h時陡增至17倍以上，呈現(xiàn)強烈反應。對于防御相關基因和，初始時基本無反應或受到抑制，受抑制時間較長，直至24 h才出現(xiàn)小幅上調(diào)表達；在12 h時凸顯9倍的上調(diào)峰值，24 h仍有2倍的上調(diào)表達；的表達量在下降、上升間轉(zhuǎn)換。對于信號轉(zhuǎn)導相關的、和，互作初期0.5 h時，和出現(xiàn)下調(diào)表達，基本無變化；隨后，為0.54—1.29倍幅度的波動，在6 h下調(diào)表達0.62倍后轉(zhuǎn)為逐步上升至1.34倍，的表達量有回升但始終未超過對照。轉(zhuǎn)錄因子基因在初始0.5 h時無反應，但隨后出現(xiàn)先下降后上升的劇烈反應，6 h時表達量下調(diào)至對照的0.1倍，12 h時回升至0.66倍，再快速提升，24 h時達到6.8倍的上調(diào)表達。由此可見，MAD1與花生互作的0.5—24 h內(nèi)，已經(jīng)誘導了花生根組織免疫相關基因的回應，反映在膜受體基因、轉(zhuǎn)錄水平的快速和顯著大幅的上調(diào)，以及防御相關蛋白基因、、和轉(zhuǎn)錄因子基因相應的調(diào)節(jié)。

對照的表達量為1，虛線表示；“*”表示相對于對照有顯著差異，p＜0.05

3 討論

微生物與植物的互作始于化學信號之間的識別和交換。本研究表明，綠僵菌黏附素MAD1是綠僵菌與花生互作初始的一個重要信號。然而，目前有關綠僵菌與植物互作機理知之甚少，對黏附素MAD1在互作中的作用未見報道。本研究克隆并分析了MAD1結(jié)構，發(fā)現(xiàn)在N端含有疏水信號肽（SP）序列，引導蛋白質(zhì)的分泌及跨膜轉(zhuǎn)移。同時C端有高度保守的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定位點。研究報道GPI錨定蛋白通常被磷酸化和糖基化，蛋白外殼由-1,6-葡聚糖、-1,3-葡聚糖和少量甲殼素構成的多聚糖層包圍，且蛋白外殼通過GPI錨以共價鍵的方式與-1,6糖苷鍵相連，同時依次與-1,3-葡聚糖的分子末端相連，將蛋白錨定在細胞膜上，在真菌對宿主的黏附、侵襲和自身形態(tài)轉(zhuǎn)換中起重要作用[20-21]。MAD1結(jié)構中的CFEM功能結(jié)構域，含有8個半胱氨酸，是真菌細胞膜蛋白特有結(jié)構。作為細胞表面受體或信號轉(zhuǎn)導器，參與細胞的黏附作用[22-23]。一些含有CFEM的真菌蛋白在侵染植物中起重要作用，例如稻瘟病菌Pth11蛋白，含有CFEM結(jié)構域，是侵染植物過程中附著胞發(fā)育所必需的[24]，這些結(jié)構預測為進一步研究MAD1的功能提供了依據(jù)。

植物通過膜表面識別受體感知和識別外來微生物化學信號，啟動下游信號轉(zhuǎn)導通路，激活或抑制相關酶及蛋白活性，協(xié)調(diào)共生與防御的關系。膜表面模式識別受體（PRR）有多種類型，包括CERK1、RPK，不同的PRR已被證明可以激活細胞免疫信號通路。CERK1（幾丁質(zhì)激發(fā)子受體激酶）具有LysM（賴氨酸基序），有跨膜激活作用，通過與CEBiP（幾丁質(zhì)激發(fā)子結(jié)合蛋白）或LYP4/6形成二聚體，來識別微生物表面的幾丁質(zhì)和肽聚糖類物質(zhì)，引起活性氧爆發(fā)和觸發(fā)MAPK級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導[25-27]。RPK含有亮氨酸重復結(jié)構域，位于細胞膜表面感知外界信號，可作為ABA信號的調(diào)節(jié)因子。RPK1功能喪失，植物在種子萌發(fā)、植株生長、氣孔關閉和基因表達方面存在ABA敏感性[28]。而ABA通路由4個核心組分共同組成一個雙重負調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)ABA對非生物脅迫包括機械壓力、損傷等耐受性的應答[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在綠僵菌MAD1處理的花生根組織中，首先是表現(xiàn)出感應識別，在0.5 h時已經(jīng)顯著上調(diào)表達，而的表達在0.5 h內(nèi)先略受抑制，然后迅速上升，24 h時強烈上調(diào)至17倍以上。這兩種膜受體上調(diào)表達引發(fā)了下游相應的信號轉(zhuǎn)導，從而協(xié)調(diào)防御和共生反應。

植物免疫系統(tǒng)在植物與微生物的互作中起著核心作用。在識別微生物相關分子模式（MAMP）時，植物會觸發(fā)免疫應答（MTI）。對于致病或有益的微生物，膜表面受體通過識別特定信號分子，可啟動或保留一定的反應來抵抗或兼容[14]。植物通過PRR對MAMP識別后，招募和調(diào)節(jié)受體激酶復合物，來激活多層免疫信號級聯(lián)反應。MAPK和MMK1可以磷酸化并激活促絲裂原活化蛋白，級聯(lián)控制了許多下游免疫信號事件，是許多微生物效應的靶標[30]。CDPK是Ca2+依賴蛋白激酶，涉及鈣信號轉(zhuǎn)導途徑。CDPK與MAPK可以共同調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子及植物早期防御反應基因的表達。尤其是胼胝質(zhì)沉積、抗菌化合物積累和防御激素的調(diào)節(jié)等[31-33]。有研究表明，MAPK級聯(lián)效應的阻斷可以抑制下游免疫基因的激活和相關防御基因的表達。例如大豆調(diào)控、和轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而抑制防御相關基因的表達[34]。還有研究表明許多來自有益微生物的共生分子可以抑制MAMP引發(fā)的根免疫反應。如根瘤菌對植物細胞的感染是由根瘤菌多糖、鞭毛蛋白和真菌甲殼素、NopL蛋白（結(jié)節(jié)蛋白L）化合物引起的，這些化合物能夠抑制宿主植物的防御反應[35]。日本短根瘤菌（）的Nod因子可以強烈抑制大豆（）和擬南芥中各種MAMP誘導的免疫反應[36]。根瘤菌的共生分子（LPS）不僅抑制植物早期活性氧的爆發(fā)，而且還抑制了后期防御相關基因轉(zhuǎn)錄重編程[37]。本研究發(fā)現(xiàn)在MAD1作用的24 h內(nèi)，信號轉(zhuǎn)導相關基因、和在初始時都先下調(diào)表達，然后有所回升，處于對照表達水平之下或小幅上下波動。表明在MAD1處理的初始0.5—12 h，花生的免疫反應被短暫的抑制，推測MAD1可能作為一種共生因子參與真菌在植物中的定殖。是一種轉(zhuǎn)錄阻遏子，應答環(huán)境變化與激素調(diào)節(jié)，與植物防衛(wèi)反應有關。PTi1、RML1A是防御相關蛋白。PTi1可與Pro互作參與抗病反應，RML1A是NBS-LRR類型的抗病蛋白，該類蛋白參與植物天然免疫系統(tǒng)的效應觸發(fā)免疫（ETI），SCW1是膜整合蛋白，與細胞壁的加固和完整性有關，涉及到植物細胞壁的破壞及重建。本研究中，在MAD1抑制信號轉(zhuǎn)導的同時，下游轉(zhuǎn)錄因子基因、抗病蛋白基因和在0.5—6 h均出現(xiàn)顯著下調(diào)表達，而和分別在12 h和24 h后出現(xiàn)急劇上調(diào)，說明MAD1作用初期誘導了花生免疫抑制因子參與兼容綠僵菌的定殖，且植物防御相關基因在短時間內(nèi)下調(diào)，而隨后激活了效應觸發(fā)免疫，增強植物抗病性，并可能通過啟動了共生建立過程所需的細胞壁修復與重建。事實上，綠僵菌在植物上的定殖和建立共生是一個動態(tài)的相互作用過程，涉及營養(yǎng)、防御等多方面信號交流和響應，期待今后有更進一步的研究闡釋。

4 結(jié)論

成功克隆并構建了綠僵菌MAD1真核表達系統(tǒng)，表達并純化出具有生物活性的MAD1蛋白。通過處理花生根證明了MAD1具有激活花生根膜受體基因和的轉(zhuǎn)錄響應，早期抑制免疫相關基因、、及防御相關基因如、的轉(zhuǎn)錄水平，有利于綠僵菌在花生根組織上定殖；另外MAD1可調(diào)控細胞壁整合基因表達，參與根上受損細胞壁的修復與重建，促進綠僵菌與花生共生關系的建立。誘導植物的免疫抑制和細胞壁重建整合可能是綠僵菌與植物建立共生關系的重要步驟。

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ExpressionofAdhesin MAD1 and its Effect on Inducing Response in Peanut

YAN Duozi, CAI Ni, WANG Feng, NONG Xiangqun, WANG Guangjun, TU Xiongbing, ZHANG Zehua

State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

【】The fungushas the characteristics of insect pathogenicity and plant symbiosis, and its adhesin MAD1 plays an important role in the infection to host insects. The objective of this study is to express MAD1 protein in eukaryotes, and to clarify the role of MAD1 in symbiosis betweenand plants. 【】Unigenes oftranscriptome were used as the reference sequence to search and compare the homology in GenBank and design primers. The genewas cloned from the cDNA template ofIPPM010202. MAD1 protein sequence was translated by DNAMAN software. The online software ProtParam was used to predict the MAD1 protein composition of amino acid and its physicochemical characteristics. The protein structure was analyzed using SMART online program. The recombinant was constructed from eukaryotic expression vector withandtransformation. The MAD1 protein was successfully expressed by methanol induction and the purified MAD1 was obtained by Ni-NTA affinity chromatography. The peanut roots were treated with immersion in the purified MAD1 solution (20 μg·mL-1) for 0.5, 6, 12 and 24 h, and then the transcription levels of membrane receptor genes (,), immune-related cascade related genes (,,) and transcription factor gene (), cell wall integrator gene () as well as defense related genes (,) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR). 【】The adhesive geneofwas cloned, with a total length of 2 136 bp, encoding 711 amino acids in molecular weight 74.8 kD. Bioinformatics analysis showed that the N-terminal of MAD1 has signal peptide, the C-terminal has a glycosylphosphatidyl inositol (GPI) anchor and contains CFEM functional domain and belongs to hydrophilic protein. The eukaryotic expression system withwas successfully constructed and the active MAD1 protein was efficiently induced, expressed and purified. The results based on qPCR of peanut roots treated with purified MAD1 showed that, for 0.5 h, the root tip cells perceived the protein and activated the expression of membrane recognition receptor gene. In 0.5-6 h, the transcriptional levels ofandwere up-regulated, the transcription level of membrane-integrated genechanged from down-regulation to up-regulation, while the transcriptional levels of,,andwere temporarily inhibited, and the transcriptional levels of defense genesandwere down-regulated, the root immune defense response was inhibited. In 6-12 h, the membrane recognition receptors maintained up-regulation, while the defensive genereversed from down-regulation to strong up-regulation. In 12-24 h,and,andwere all up-regulated,,,andappeared slightly up-regulated, the roots initiated immune defense response.【】In the early stage of the interaction betweenand peanut roots, the adhesin MAD1 protein activates the membrane receptor genesandrecognition response in peanut at 6 h, while inhibits the expression of peanut immune cascade genes,,and defense related genes such asand, which is helpful for the colonization ofin peanut root tissue. Subsequently, it induces the up-regulation of expression of cell wall integrin gene, which participates in the repair and reconstruction of damaged cell wall on the root, and promotes the establishment of symbiotic relationship betweenand peanut. Induction of plant immunosuppression and integral cell wall reconstruction may be important steps in the establishment of symbiotic relationship betweenand plants.

MAD1;; symbiosis; plant immunity; defense; eukaryotic expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.04.007

2020-05-09；

2020-06-10

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0201205，2018YFD0201002，2017YFD0200402）

閆多子，E-mail：yanduozi@163.com。通信作者農(nóng)向群，E-mail：xqnong@sina.com

（責任編輯 岳梅）