宿蕾艷，張莎莎，張明明，魏春秀，方素萍，王穎，胡瑛，莊曾淵

眼部調(diào)節(jié)和集合功能異常，睫狀肌和內(nèi)直肌功能紊亂，可導(dǎo)致神經(jīng)支配的異?；蚣∪獾倪^(guò)度緊張，引起視疲勞。眼的調(diào)節(jié)功能是依賴睫狀體平滑肌的收縮和舒張來(lái)實(shí)現(xiàn)的，與細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平關(guān)系密切。大鼠肉瘤（rat sarcoma，RAS）同源基因家族成員A（ras homolog gene family member A，RhoA）及蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是平滑肌收縮的關(guān)鍵信號(hào)蛋白[1-3]。中醫(yī)認(rèn)為視疲勞屬于“肝勞”，其核心病機(jī)是陰血不足、筋膜攣急。目舒丸為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有活血養(yǎng)血，解痙止痛的功效，臨床上用于治療視疲勞，療效確切[4-5]。本實(shí)驗(yàn)擬在細(xì)胞水平觀察目舒丸對(duì)兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞舒縮的影響，研究目舒丸治療視疲勞的機(jī)制，為其臨床合理應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用3 月齡新西蘭大白兔，10 只，體重2.5～3.0 kg，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)條件：12 h/12 h 交替光暗，溫度25℃，濕度55%左右，自由飲食、飲水，動(dòng)物房環(huán)境保持安靜、通風(fēng)良好。

1.2 主要試劑與儀器

氯化乙酰膽堿（上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：A0084）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：HERA CELL 150）；超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號(hào)：SCB-1360）；倒置顯微鏡（美國(guó)，型號(hào)：OLYMPUS B071）；冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司，型號(hào)：1-14PK），酶標(biāo)儀（美國(guó)BioRad 公司，型號(hào)：1450）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（美國(guó)BIO-RAD，型號(hào)：CFX96），基因擴(kuò)增儀（美國(guó)BIO-RAD，型號(hào)：C1000）。

1.3 取材

取上述新西蘭大白兔，無(wú)菌條件下摘取兔眼球，用含雙抗的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，沿角膜緣后3 mm 處切開眼球，去除晶體，剪除虹膜，取下完整睫狀肌帶，沖洗后剪碎，加入3 mL V 型膠原酶消化2 h，終止消化，1500 r/min離心5 min，于沉淀中加入平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打均勻，得到原代兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d 后細(xì)胞傳代培養(yǎng)，傳代得到第3 代睫狀體平滑肌細(xì)胞可用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

目舒丸溶液配置：稱取160 mg 目舒丸顆粒加入10 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液充分溶解，之后使用0.45 μm 微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到濃度為16 mg/mL 的目舒丸濃溶液，濃溶液用于稀釋不同終濃度目舒丸溶液。

1.4 分組與給藥

將1.3 得到的第3 代睫狀體平滑肌細(xì)胞以1×106個(gè)/mL 均勻接種于5 個(gè)6 孔板中，鋪板24 h 后，隨機(jī)選出27 個(gè)接種孔，并隨機(jī)分為9組，每組3 個(gè)孔，分別命名為A組～I(xiàn)組。將1.3 得到的目舒丸溶液稀釋成7 個(gè)濃度，依次為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL 并分別加入到A～G組中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞10 min。H組予氯化乙酰膽堿（0.5 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)2 h，I組予目舒丸溶液（1.0 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后予氯化乙酰膽堿（0.5 mmol/L）培養(yǎng)2 h。

1.5 兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度測(cè)定

A組～G組在給藥前及給藥后的0.5、1、2、4 和10 min 這6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別在相差顯微鏡下用測(cè)微器測(cè)定細(xì)胞直徑，每個(gè)接種孔觀察6 個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)10 個(gè)細(xì)胞，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKC、RhoA 基因表達(dá)

將H組和I組細(xì)胞離心，收集各組細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。按照總核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）抽提試劑說(shuō)明書提取總RNA（表1）。反轉(zhuǎn)錄：各組樣品取1 μg總RNA，按M-MLV First Strand RT Kit 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)：以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，應(yīng)用熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)胞中PKC、RhoA 的基因表達(dá)。25 μL 反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃3 min，變性94℃30 s，退火72℃3 min，以上2 步擴(kuò)增循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線。再根據(jù)2-ΔΔCt公示計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0 系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞形態(tài)及鑒定

兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)12 h 后，細(xì)胞開始貼壁，剛貼壁的細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞相對(duì)較小，培養(yǎng)2 d 后，貼壁細(xì)胞增多，并逐漸伸展，原代細(xì)胞形態(tài)不一，多呈梭型，有少數(shù)細(xì)胞突起，呈單個(gè)生長(zhǎng)或幾個(gè)細(xì)胞以突起相連接（圖1A）。

兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞免疫組化鑒定：培養(yǎng)的睫狀體平滑肌細(xì)胞為α-actin 免疫反應(yīng)陽(yáng)性，陽(yáng)性物質(zhì)位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色，胞核不著色；倒置顯微鏡下可見胞核無(wú)色，胞漿呈棕黃色（圖1B）。

圖1 兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞形態(tài)及組化鑒定圖。1A 原代兔睫狀體平滑肌細(xì)胞形態(tài)圖（×200）；1B 兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞為αactin 免疫反應(yīng)陽(yáng)性（×400），陽(yáng)性物質(zhì)位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色，細(xì)胞核不著色

2.2 兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞直徑比較

給藥前后比較：A組給藥后所有時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞直徑較給藥前均縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t0.5min=6.347，t1min=6.582，t2min=10.870，t4min=11.480，t10min=5.005，均P=0.000）。B組給藥后所有時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組給藥后4、10 min 細(xì)胞直徑均伸長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t4min=2.086，P=0.039；t10min=2.300，P=0.024）；余時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。D組給藥后1、2、4、10 min細(xì)胞直徑均伸長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1min=2.794，P=0.006；t2min=3.294，P=0.001；t4min=3.109，P=0.003；t10min=2.821，P=0.006）；給藥后0.5 min 細(xì)胞直徑變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。E組給藥后2、4、10 min 細(xì)胞直徑均伸長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t2min=2.389，P=0.019；t4min=3.271，P=0.002；t10min=3.983，P=0.000）；余時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。F組給藥后所有時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。G組給藥后所有時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

組間比較：與A組給藥后各時(shí)間點(diǎn)比較，B～G組細(xì)胞直徑均伸長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與B組給藥后10 min 比較，E組細(xì)胞直徑縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），余組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與余時(shí)間點(diǎn)比較，C～G組細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與C組給藥后0.5 min 比較，E組細(xì)胞直徑縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），余組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與給藥后1 min，D、G組細(xì)胞直徑伸長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），余組細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與余時(shí)間點(diǎn)比較，D～G組細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與D 給藥后10 min 比較，E組細(xì)胞直徑伸長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），余組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與余時(shí)間點(diǎn)比較，E～G組細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與E組給藥后0.5 min 比較，F(xiàn)組細(xì)胞直徑伸長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），G組細(xì)胞直徑變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與余時(shí)間點(diǎn)比較，F(xiàn)、G組細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與F組給藥后2 min 比較，G組細(xì)胞直徑伸長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與余時(shí)間點(diǎn)比較，G組細(xì)胞直徑變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2、3）。

表2 不同濃度目舒丸溶液干預(yù)前、后兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞直徑比較（，n=3，μm）

表2 不同濃度目舒丸溶液干預(yù)前、后兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞直徑比較（，n=3，μm）

注：* 與同組組給藥前比較，P＜0.05；# 與A組比較，P＜0.05；△與B組比較，P＜0.05；○與C組比較，P＜0.05；◇與D組比較，P＜0.05；▲與E組比較，P＜0.05；●與F組比較，P＜0.05

表3 不同濃度目舒丸溶液干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞直徑統(tǒng)計(jì)值

2.3 兔眼睫狀體平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKC 及RhoA 基因表達(dá)

與H組比較，I組的PKC 及RhoA 表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tPKC=-3.566，P=0.023；tRhoA=-8.895，P=0.001）（表4）。

表4 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果（，n=3）

表4 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果（，n=3）

3 討論

中醫(yī)將視疲勞歸于“肝勞”，肝血耗損、過(guò)度使用腦力及目力，都會(huì)導(dǎo)致目竅失養(yǎng)，無(wú)法久視。調(diào)節(jié)痙攣是視疲勞的常見原因，現(xiàn)代工作方式造成調(diào)節(jié)痙攣發(fā)生的普遍性，但臨床除了屈光矯正，并無(wú)有效治療方法。

目舒丸為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院莊曾淵教授多年經(jīng)驗(yàn)方加工而成，治療眼視疲勞，癥見眼珠隱痛、頭額悶痛、不能久視、視力模糊、常欲閉目，臨床療效較好。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定了6 個(gè)時(shí)間水平，考察7 個(gè)目舒丸劑量梯度來(lái)觀察其對(duì)眼睫狀體平滑肌細(xì)胞舒縮作用時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系，及對(duì)睫狀體平滑肌細(xì)胞內(nèi)與收縮有關(guān)的鈣依賴性及非鈣依賴性信號(hào)傳導(dǎo)因子的影響。

原代培養(yǎng)的兔睫狀體平滑肌細(xì)胞具有很好的收縮功能，是研究睫狀體生理及藥理作用的良好實(shí)驗(yàn)材料。本研究采用組織膠原酶消化法成功獲得原代兔睫狀肌細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形，α-actin 染色強(qiáng)陽(yáng)性，與已有國(guó)外文獻(xiàn)一致[6-7]。原代睫狀體平滑肌細(xì)胞給予不同濃度目舒丸干預(yù)一定時(shí)長(zhǎng)后發(fā)現(xiàn)，目舒丸可顯著影響睫狀肌細(xì)胞的收縮狀態(tài)，并呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性，尤其是1.0 mg/mL 目舒丸干預(yù)細(xì)胞10 min內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其能顯著舒張平滑肌。

RhoA 是單體G 蛋白中結(jié)構(gòu)較為保守的蛋白，其C 端可以參與正確定位蛋白與翻譯后的修飾，N 端則具有可以與鳥苷三磷酸（guanosine-5′-triphosphate，GTP）結(jié)合并參與水解的大部分氨基酸[8]。RhoA 結(jié)構(gòu)中存在具有催化功能的氨基酸，這些氨基酸主要在GTP 水解過(guò)程中發(fā)生作用。肌動(dòng)蛋白聚合受到RhoA 蛋白的影響，促使細(xì)胞粘附，肌動(dòng)球蛋白收縮等。目前，參與細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的重要信號(hào)通路是RhoA-ROCK[9]。RhoA 激活Rho 相關(guān)激酶，促進(jìn)細(xì)胞粘附、改變細(xì)胞形態(tài)以及促使細(xì)胞骨架拉伸，Rho 激酶（Rho-associated kinase，ROCK）活化狀態(tài)持續(xù)，激活肌球蛋白輕鏈磷酸化會(huì)促使ROCK 進(jìn)一步拉伸細(xì)胞骨架，同時(shí)加強(qiáng)RhoA-ROCK 的耦合。ROCK 激活可以促使肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）磷酸化而產(chǎn)生肌絲收縮作用，同時(shí)活化后ROCK 的底物是磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light-chain phosphatase，MLCP）。磷酸化是在接受Rho/ROCK 的活化信號(hào)后產(chǎn)生的，失活后，同時(shí)也使磷酸化的MLC 脫磷酸失活狀態(tài)的終止，從而提高胞漿內(nèi)磷酸化MLC 水平，增加肌球-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)。在鈣水平相同的條件下，MLC 磷酸化的程度增加，細(xì)胞收縮強(qiáng)度增加，說(shuō)明收縮蛋白對(duì)鈣的敏感性的增加，這一過(guò)程稱為鈣敏感性調(diào)節(jié)。

PKC 是一種存在于胞質(zhì)的依賴鈣和磷脂酶的蛋白激酶，其活性影響著細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)活動(dòng)[9]。另外，PKC 可以通過(guò)p44/42MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)使鈣黏蛋白（cadherin，CaD）和P-鈣粘蛋白（Pcadherin，CaP）發(fā)生磷酸化，促使它們對(duì)肌球蛋白ATP 酶活性的抑制作用消失，從而調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收縮[10-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在加入氯化乙酰膽堿24 h 前加入目舒丸，發(fā)生作用后，與單純加入氯化乙酰膽堿組相比，細(xì)胞內(nèi)PKC 及RhoA 表達(dá)量下降，推測(cè)目舒丸可通過(guò)降低睫狀體平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKC 及RhoA 的表達(dá)，減少非鈣依賴通道引起的睫狀體平滑肌細(xì)胞收縮，進(jìn)而改善睫狀體平滑肌過(guò)度收縮引起的眼部調(diào)節(jié)功能異常。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)目舒丸可通過(guò)降低睫狀體平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKC 及RhoA 的表達(dá)，減少非鈣依賴通道引起的睫狀體平滑肌細(xì)胞收縮，進(jìn)而改善睫狀體平滑肌過(guò)度收縮引起的眼部調(diào)節(jié)功能異常。