程雪婷陳妍靈黃曉東?

(1. 武漢大學中南醫(yī)院,武漢 430071; 2. 武漢大學同仁醫(yī)院,武漢 430060)

空腸彎曲桿菌是一種人獸共患的食源性病原菌,主要與家禽和家畜有關[1-2]。根據(jù)感染的分離株類型、細菌數(shù)量和宿主免疫狀態(tài)不同,導致患者有不同程度的胃腸炎、伴或不伴血性腹瀉、發(fā)燒、腹痛[3]?？漳c彎曲桿菌感染通常是一種自限性疾病[4],少數(shù)情況下可以導致格林—巴利綜合征(Guillain-Barré syndrome,GBS)、反應性關節(jié)炎和腸易激綜合征或乳糜瀉在內(nèi)的長期后遺癥[5]。由于世界范圍內(nèi)感染數(shù)量的增加,抗生素抗性分離株[6]和感染后后遺癥的出現(xiàn),這種細菌已成為威脅人類健康的重要病原體。

盡管小鼠是常用的微生物感染模型,但是常規(guī)的空腸彎曲桿菌小鼠感染模型存在定植困難或不出現(xiàn)疾病表現(xiàn)等缺陷[6],導致我們?nèi)狈τ行У男∈蟾腥灸Ｐ?阻礙了彎曲菌病的研究。成功構建小鼠感染模型需要我們對感染模型建立的關鍵因素進行了解,并對常規(guī)小鼠模型進行改良。宿主與微生物相互作用是常見的影響細菌定植和感染后臨床表現(xiàn)的原因[7],本文從菌株和小鼠兩個角度出發(fā),綜述了影響空腸彎曲桿菌感染模型建立的關鍵因素,以期為成功建立合適的小鼠感染模型提供參考。

1 菌株對構建感染模型的影響

1.1 與定植相關的毒力因子

空腸彎曲桿菌的一些毒力因子可以影響細菌的粘附、侵襲、定植等多種功能,對于該菌的致病性至關重要[8]。粘附被認為是空腸彎曲菌在雞[9]、人[10]及鼠[11]的和定植中起重要作用的因素?？漳c彎曲菌合成了幾種粘附素:纖維連接蛋白結合外膜蛋白F(fibronectin-binding outer membrane protein,CadF)以及纖維蛋白A(fibrillarin A,FlpA)被認為是重要的毒力因子,能促進空腸彎曲桿菌對宿主細胞的粘附,并使其能夠在高水平下定植[12-13]。侵襲對于空腸彎曲菌的毒力有重要作用,絲氨酸蛋白酶(high-temperature requirement factor A,HtrA)通過破壞腸道緊密連接,造成腸道屏障缺陷,有利于空腸彎曲桿菌侵襲[14]。Heimesaat 等[15]發(fā)現(xiàn)用HtrA 突變型菌株感染幼鼠,幼鼠的肝、腎、肺部出現(xiàn)的炎癥變化均低于野生株。鞭毛蛋白A(flagellin A,FlaA)、鞭毛蛋白B(flagellin A,FlaB)和鞭毛生物合成蛋白(flagellar biosynthesis protein,FlhF)參與組成鞭毛被認為對于宿主粘附和侵入起作用。Schmidt等[16]的研究發(fā)現(xiàn)FlaA 和FlaB 缺陷型小鼠并不影響細菌定植,但是對于引起彎曲菌病的臨床表現(xiàn)是必不可少的。Ren 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)FlhF 失活導致空腸彎曲桿菌在雞的定植減少且完全喪失在小鼠中的連續(xù)定植能力。此外,空腸彎曲菌的特定代謝能力對于其在各種宿主的腸道定植中起重要作用,一些代謝相關基因的缺失會導致細菌生長或定植受限[18-19]。常見的代謝相關基因包括:過氧化氫酶(catalase, katA)、 超 氧 化 物 歧 化 酶(superoxide dismutase,sodB)、天門冬氨酸/谷氨酸結合蛋白(aspartate/glutamate-binding protein,peb1A)、天冬氨酸酶(aspartoacylase, aspA)、 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,aspB)等(表1)。對菌株的基因分析可幫助鑒定那些在小鼠模型中易感的空腸彎曲桿菌的分離株。

表1 影響空腸彎曲桿菌在宿主定植和生長的代謝相關基因Figure 1 Metabolic related genes that influence the colonization and growth of Campylobacter jejuni in the host

1.2 與疾病表現(xiàn)相關的毒力因子

空腸彎曲桿菌感染后的不同臨床表現(xiàn)與單個分離株的不同毒力潛力相關。一部分空腸彎曲桿菌分離株通過產(chǎn)生一種緊密連接毒素(zonula occludens toxin,ZOT)能靶向破壞細胞間緊密連接,被認為可能導致腹瀉[27-28]。小鼠實驗中證實,一些臨床分離株可以在小鼠肝中定植和誘發(fā)肝炎,這可能與菌株產(chǎn)生的肝毒性因子有關[29-30]。目前對于肝毒性因子研究較少,具體成分未知。以往研究表明, 空 腸 彎 曲 桿 菌 表 達 的 脂 寡 糖(lipooligosaccharide,LOS)誘導與神經(jīng)組織中神經(jīng)節(jié)苷脂的分子模擬被認為誘導交叉反應抗體,導致易感宿主觸發(fā)急性多發(fā)性神經(jīng)病-格林-巴利綜合征(GBS)[31],Godschalk 等[32]發(fā)現(xiàn)GBS 相關菌株中特定的LOS 基因座的表達過高,并伴隨神經(jīng)節(jié)苷脂模擬結構的表達增加,提示LOS 基因座與GBS 和神經(jīng)節(jié)苷脂模擬物有關。有研究發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌可通過細胞致死腫脹毒素促進結直腸癌的發(fā)生[33],這表明一些空腸彎曲桿菌毒素有潛在致癌性。不同毒力因子可能導致不同疾病表現(xiàn),這在我們構建不同疾病模型時需要考慮。

2 宿主因素對構建感染模型的影響

2.1 小鼠品系

小鼠的品系可以對空腸彎曲桿菌感染的敏感性產(chǎn)生影響。Vuckovic 等[34]比較了三種不同品系小鼠(BALB/c、C57BL/6 和DBA/2)感染空腸彎曲桿菌后的臨床表現(xiàn)。結果顯示,在感染小鼠的肝和脾可以看到細菌和炎癥反應,BALB/c 小鼠最明顯,此外,BALB/c 小鼠原發(fā)性肝感染的持續(xù)時間最長。Baqar 等[35]通過小鼠鼻內(nèi)感染比較了空腸彎曲桿菌菌株81-176 對BALB/c、C3H/Hej、CBA/CAJ 或C58 J三種小鼠品系的感染毒性,BALB/c 小鼠組的死亡率最高,C58 J 組死亡率最低,BALB/c 小鼠表現(xiàn)出比其它小鼠更強的毒性反應。以上結果表明不同小鼠品系對空腸彎曲桿菌的敏感性不同,雖然BALB/c 小鼠感染后的炎癥反應相對更明顯,但是其對細菌毒性的不耐受可能限制了其作為動物模型的利用。

2.2 免疫缺陷

常規(guī)小鼠作為空腸彎曲桿菌感染模型時不存在顯著炎性/免疫應答反應[36],這可能是小鼠先天免疫系統(tǒng)對空腸彎曲桿菌的耐受性更高[37]。然而,免疫缺陷鼠對空腸彎曲桿菌等人類病原體敏感更高,利用基因敲除技術構建免疫缺陷小鼠也常應用于構建空腸彎曲桿菌感染模型[38]。目前常用的是IL-10 缺陷的小鼠模型[39-40],空腸彎曲桿菌可以在IL-10-/-小鼠模型穩(wěn)定地定居,具有高致病性負荷,并患有非自限性急性小腸結腸炎,出現(xiàn)血性炎性腹瀉,因為它模仿了人彎曲菌病的關鍵特征,常被用于空腸彎曲桿菌的研究。然而,IL-10-/-小鼠模型必須在無菌環(huán)境下飼養(yǎng),因為它傾向于受自身腸道微生物影響而發(fā)展成自發(fā)性結腸炎,使這個模型存在缺陷[41]。SIGIRR-/-小鼠模型的建立可以避免上述缺陷,空腸彎曲桿菌在這些小鼠的定植率很高,腸道表現(xiàn)出明顯的炎癥組織學跡象,病理學上類似于人類空腸彎曲桿菌的急性感染,也是研究空腸彎曲桿菌導致胃腸道表現(xiàn)的有利模型[41-42]。

2.3 腸道菌群

空腸彎曲桿菌定植除了與宿主細胞有關,也與宿主的腸道菌群有關。常規(guī)的鼠感染模型中存在定植困難或不出現(xiàn)疾病表現(xiàn),這可能是由于是鼠微生物群提供的定植抗性所致[43-44]。人們普遍認為“定植抗性”是由于原有的腸道菌群在和新來的病原體競爭腸道資源時處于優(yōu)勢,一旦原有微生物群落破裂,就會有足夠的營養(yǎng)和場地以供空腸彎曲桿菌棲息,通過去除競爭性共生細菌可以促進定居[45]。許多研究結果支持這一假設,無菌或微生物區(qū)系有限的小鼠很容易被空腸彎曲桿菌定植[46]。在感染前利用單一抗生素[47-49]或抗生素合劑[46]也可以使小鼠更容易感染空腸彎曲桿菌。在使用抗生素后對小鼠的腸道微生物組進行分析后發(fā)現(xiàn),微生物多樣性水平下降,尤其是糞腸球菌[8]。進一步研究發(fā)現(xiàn)特定的厭氧菌菌群可以預防空腸彎曲桿菌引起的結腸炎,給小鼠服用對厭氧菌敏感的克林霉素可以誘導空腸彎曲桿菌致結腸炎[48]。Mohan等[50]發(fā)現(xiàn)益生菌可以減少小鼠的感染率和降低腸道炎癥程度,這可能得益于益生菌增加了腸道微生物豐富度,提升了定植抗性。此外,嬰兒小鼠容易感染空腸彎曲桿菌和腸道炎癥[15],這表明早期的微生物群可能無法提供與“成人”菌群相同的保護作用。Bereswill 等[46]發(fā)現(xiàn)用“人源化”菌群代替常規(guī)飼養(yǎng)的小鼠的菌群時,它有助于空腸彎曲菌的定植。這種機制尚不清楚,推測可能是“人源化”微生物群可能提供了促進空腸彎曲桿菌定植的營養(yǎng)優(yōu)勢。綜上,宿主的腸道菌群穩(wěn)態(tài)和豐富的菌群多樣性不利于空腸彎曲桿菌感染,腸道無菌狀態(tài)、腸道微生物多樣化水平下降、人源化腸道菌群都有利于空腸彎曲桿菌感染。

2.4 飲食組成

飲食組成對腸道菌群的影響也會對空腸彎曲菌定植產(chǎn)生影響[39]。Brown 等[51]發(fā)現(xiàn)用低脂/低蛋白飲食建立的小鼠營養(yǎng)不良模型進行的實驗證明營養(yǎng)不良會導致腸道屏障功能下降,腸道通透性增加,并引起小腸微生物群和代謝改變,從而增加了腸道感染的易感性。Bereswill 等[52]發(fā)現(xiàn)喂食“西式飲食”的小鼠以及具有常規(guī)微生物群的肥胖小鼠會使小鼠更容易感染空腸彎曲桿菌。最近報道了鋅缺乏對抗生素預處理小鼠中空腸彎曲桿菌感染的癥狀形成有直接影響[53],此外,與正常患者相比,克羅恩病患者血清鋅濃度更低并對空腸彎曲桿菌更加易感[54],提示缺鋅可能會增加宿主對空腸彎曲桿菌易感性。

2.5 宿主適應

空腸彎曲桿菌可以通過宿主適應增強對宿主感染,這可能是因為宿主的免疫應答對細菌造成選擇性壓力,間接的篩選出了那些更能適應宿主的細菌[37]。Bell 等[41]發(fā)現(xiàn)通過分離小鼠糞便的空腸彎曲桿菌進行培養(yǎng)后再感染小鼠,這種連續(xù)傳代培養(yǎng)重復四次,小鼠發(fā)病率和疾病嚴重程度增加。進一步研究表明空腸彎曲桿菌在經(jīng)過宿主適應后,一些關鍵的突變基因會促進菌株在宿主的定植[55-56]。這提示我們經(jīng)過宿主適應的分離株可能更有利于細菌在小鼠的成功定植。

3 結語

空腸彎曲桿菌的不同毒力因子通過影響細菌的粘附性、侵襲性以及生長代謝等功能,對細菌的定植以及產(chǎn)生不同疾病表現(xiàn)產(chǎn)生作用。以往研究已經(jīng)證實一些基因在空腸彎曲桿菌的宿主定植和產(chǎn)生不同疾病表現(xiàn)中發(fā)揮關鍵作用。通過分析空腸彎曲桿菌的基因信息可以幫助我們在小鼠模型中鑒定易感的細菌分離株及構建特定疾病表現(xiàn)的模型。常規(guī)小鼠模型對于空腸彎曲桿菌存在定植抗性,通過小鼠的基因改造、使用幼鼠、改變小鼠飲食、利用無菌鼠或感染前使用抗生素、菌株的連續(xù)傳代和采用人源化菌群等方式有利于構建小鼠感染模型,目前應用最廣泛的方式是基因改造、應用GF 級小鼠和感染前使用抗生素,鑒于基因改造和GF 級小鼠的成本較高,最廉價的方式是使用抗生素。菌株的連續(xù)傳代和采用人源化菌群雖然可增強對宿主感染,但其操作復雜、周期長,因而目前并不常用。此外,雖然飲食改造的方式目前并不常用,但其成本低廉且操作簡單,相信在未來可以有更廣泛的應用。通過對有利于構建小鼠感染模型的因素進行分析,可以幫助我們尋找更加方便、廉價和更能反映疾病特征的小鼠模型,為彎曲菌病的研究提供科學基礎。