張毅程晨蘇景超張新芳劉心月項(xiàng)水英王彩云李尹林先剛劉自兵?

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,合肥 230038; 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,合肥 230038;3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸經(jīng)絡(luò)研究所,合肥 230038; 4. 針灸基礎(chǔ)與技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 230038)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是由于肺內(nèi)外致病因素造成彌漫性炎性肺泡浸潤、出血、肺水腫和透明膜形成,患者血氧結(jié)合能力降低為主的危急癥候,嚴(yán)重者發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[1-2]。在過去的二十年里,已經(jīng)開發(fā)了幾種治療策略,并取得了顯著的進(jìn)展;然而,死亡率仍然很高,超過三分之一的患者死亡,一些幸存者由于長期低氧而出現(xiàn)腦損傷等并發(fā)癥[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和肺泡毛細(xì)血管膜通透性增加在急性肺損傷的病理生理機(jī)制中起重要作用[5]。制備穩(wěn)定的動(dòng)物模型對(duì)觀察ALl 病理改變和探究潛在藥物作用機(jī)制和防治并發(fā)癥等具有重要意義。目前關(guān)于ALI 模型制備途徑主要分為原發(fā)誘導(dǎo)和繼發(fā)誘導(dǎo)兩種。原發(fā)誘導(dǎo)通過向氣管內(nèi)滴注脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)[6]、鹽酸[7]、活的(或熱殺死)細(xì)菌和病毒[8]等物質(zhì)直接誘導(dǎo)肺部損傷,而繼發(fā)誘導(dǎo)則是由其他疾病誘發(fā)ALI 包括燒傷[9]、腹腔注射LPS[10]、盲腸結(jié)扎穿刺等[11]。脂多糖刺激已被廣泛認(rèn)為是通過致炎建立與臨床相關(guān)的ALI 動(dòng)物模型的有效策略[12-13]。LPS誘導(dǎo)的ALI 動(dòng)物模型肺部炎性細(xì)胞聚集、肺泡毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致彌漫性肺水腫、肺出血等癥[14-15]。本研究通過氣管滴注LPS 法直接對(duì)大鼠肺造成損傷[16-17],建立急性肺損傷動(dòng)物模型,探究肺損傷程度在不同時(shí)間段是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32只8周齡成年SPF 級(jí)雄性SD 大鼠,體重(230 ± 20)g,由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供【SCXK(皖)2019-0002】,飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(皖)2019-005】,使用許可證號(hào)經(jīng)安徽科技廳審批。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,室溫(23 ± 2)℃,大鼠分籠飼養(yǎng),自由飲水、攝食。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年9月科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》,所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審查號(hào):AHUM-rats-2020009)。

1.1.2 主要試劑與儀器

脂多糖(L2880,美國Sigma 公司);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、白介素-8(IL-8)ELISA 試劑盒(武漢基因美科技有限公司);丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究院);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究院)。

手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械股份有限公司);小動(dòng)物呼吸功能檢測(cè)儀(北京貝蘭博科技公司);Ani-Res2005 動(dòng)物肺功能分析軟件(北京貝蘭博科技公司);電子天平(上海菁海儀器有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);Image J生物醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(美國國立衛(wèi)生研究院)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

32 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組和模型組,正常組8 只大鼠,模型組24 只大鼠,模型組依據(jù)LPS 滴注時(shí)長不同分為3 個(gè)亞組:3 h 組、6 h組和12 h 組,每組8 只,造模過程中大鼠死亡,采用差額補(bǔ)充的方法以保證每組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例數(shù)。

1.2.2 模型制備

8 只正常組大鼠不進(jìn)行任何處理。24 只模型組大鼠采用脂多糖(LPS)氣管滴注法[16-17]建立ALI大鼠模型,用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉后固定于解剖臺(tái)上,沿頸正中線手術(shù)暴露氣管,采用氣管插管的方式向大鼠氣管內(nèi)滴注LPS(2 mg/kg),氣管滴注后將大鼠直立,垂直旋轉(zhuǎn)大鼠,使藥物能在大鼠肺部均勻布散,以制備急性肺損傷模型,按組別于3、6、12 h 末檢測(cè)肺功能和取材。

1.2.3 觀察大鼠一般狀況

氣管滴注LPS 后,將大鼠放回飼養(yǎng)籠,給予充足的飼料和水,觀察所有大鼠飲食、活動(dòng)、呼吸頻率等一般狀況。

1.2.4 肺功能檢測(cè)

大鼠于3、6、12 h 各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)完肺功能,大鼠稱重后3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉,行氣管切開后插管,保持氣道暢通。大鼠仰臥位放于體描箱中,通過導(dǎo)管連接呼吸機(jī)和信號(hào)調(diào)理器,使用肺功能檢測(cè)軟件,檢測(cè)大鼠用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、第0.1 秒用力呼氣量(forced expiratory volume in 0.1 s,FEV 0.1)、第0.1 秒用力呼氣量與用力肺活量比值(FEV 0.1/FVC)、第0.3秒用力呼氣量(forced expiratory volume in 0.3 s,FEV 0.3)、第0.3 秒用力呼氣量與用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)。

1.2.5 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠BALF 中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8 含量

收集支氣管肺泡灌洗液,將大鼠開胸,結(jié)扎左總支氣管,用注射器插入氣管插管上端,取8 mL 生理鹽水分3 次注入右肺,反復(fù)沖洗并回收3 遍灌洗液,將收集的BALF 離心取上清液,采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)各指標(biāo)含量,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書加樣,用酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值,計(jì)算實(shí)際樣品的濃度。

1.2.6 觀察肺大體改變

大鼠在抽取支氣管肺泡灌洗液后,解剖胸腔立即進(jìn)行肺組織取材,觀察大鼠肺組織大體改變。

1.2.7 確定肺濕干重(W/D)比

大鼠處死后取左肺,將左肺置于濾紙上去除多余水分并稱濕重(W),標(biāo)記組別后將肺組織連同濾紙一同放入60℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥,48 h 后干燥完畢,將濾紙與左肺一同取出稱干重(D),計(jì)算肺濕干重比值,評(píng)估肺水腫。

1.2.8 試劑盒檢測(cè)MDA、SOD 含量

取100 mg 肺組織搗碎勻漿,在4℃條件下3500 r/min,離心10 min,取上清并保存于-80℃?zhèn)溆?。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,用酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值,計(jì)算實(shí)際樣品濃度。

1.2.9 HE 染色法觀察肺組織病理學(xué)變化

取右肺上葉,4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,切片(5 μm),二甲苯脫蠟脫水,蘇木精染色,封片后,10 × 40 倍鏡下拍照,用Image J 軟件觀察分析大鼠肺組織病理變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均在SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的死亡率/存活率

24 只模型組大鼠采用氣管內(nèi)滴注LPS 法建模,從造模后到取材前3 h 組、6 h 組和12 h 組大鼠均存活,存活率為100%。

2.2 大鼠的一般狀況

大鼠氣管滴注LPS 后,3 h 組與正常組相比,精神處于淡漠狀態(tài),未見攝食及飲水,蜷臥籠角,活動(dòng)減少,鼻腔處粘液分泌物增多,部分大鼠鼻腔分泌粘液為血性粘液,大鼠的呼吸頻率加快,胸廓起伏加深,可聞及哮鳴音。6 h 組與3 h 組比較,大鼠少量飲水,活動(dòng)次數(shù)增加,鼻腔粘液分泌物減少,呼吸頻率較3 h 組平穩(wěn)。12 h 組大鼠精神狀況趨于平穩(wěn),攝食及飲水次數(shù)增多,鼻腔處未見明顯粘液分泌,呼吸平穩(wěn),未見明顯哮鳴音。

2.3 大鼠肺大體觀察

LPS 氣管灌注3、6、12 h 后,與正常組相比,3 h組左右肺門處可見肺組織肝樣變,該肝樣變區(qū)域由肺門處往肺周邊蔓延,具有明顯的分界,左右肺葉上散布出血點(diǎn),出血部位顏色鮮紅;6 h 組表現(xiàn)為右肺上葉處肝樣變出血,區(qū)域占比為右肺面積10% ～20%;12 h 組右肺上葉處和右肺中葉處有大片肝樣變出血,區(qū)域占比為右肺面積的50% ～60%,出血部位顏色呈深褐色,表明肺出血較6 h 組加劇(見圖1)。

圖1 不同損傷時(shí)間節(jié)點(diǎn)觀察圖Figure 1 Observation of nodes with different damage time

2.4 肺功能

各組大鼠FVC 差異不顯著(P＞0.05),與正常組相比,3 h 組FEV 0.1、FEV 0.1/FVC、FEV 0.3、FEV 0.3/FVC 均下降明顯(P＜0.05,P＜0.01);6 h組FEV 0.3、FEV 0.3/FVC 明顯降低(P＜0.05),FEV 0.1 和FEV 0.1/FVC 數(shù)值降低,但不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);12 h 組FEV 0.1、FEV 0.3、FEV 0.1/FVC、FEV 0.3/FVC 下降明顯(P＜0.05,P＜0.01)。3 h 組與6 h 組比較,FEV 0.1、FEV 0.1/FVC 差異顯著(P＜0.05)(圖2)。

圖2 大鼠肺功能指標(biāo)比較(±s,n=8)Note. Compared with the normal group, ?P＜0.05, ??P＜0.01. Compared with 3 h group, #P＜0.05. (The same in the following figures)Figure 2 Comparison of pulmonary function indexes in rats(±s,n=8)

2.5 左肺濕干重比值

3 h 組與正常組比較,大鼠左肺濕/干重比值明顯增加(P＜0.01),6 h 組與正常組比較,差異具有顯著性(P＜0.05),12 h 組與正常組比較,差異具有顯著性(P＜0.01)。3 h 組與6 h 組比較,3 h 組濕干重比值更顯著(P＜0.05)(圖3)。

2.6 支氣管肺泡灌洗液中促炎因子含量

3 h 組與正常組比較,BALF 中IL-1β、IL-8、TNFα 含量明顯升高(P＜0.01),6 h 組與正常組比較,BALF 中IL-1β、IL-8、TNF-α 含量顯著升高(P＜0.05,P＜0.01),12 h 組與正常組比較,BALF 中IL-1β、IL-8、TNF-α 含量上升明顯(P＜0.01),3 h 組與6 h 組、12 h 組比較,IL-1β、IL-8、TNF-α 升高顯著(P＜0.01),6 h 組與12 h 組比較,IL-8、TNF-α 含量具備明顯差異(P＜0.01)(圖4)。

圖3 大鼠左肺濕/干重比值比較(±s,n=8)Figure 3 Comparison of wet/dry weight ratio of left lung in rats(±s,n=8)

圖4 BALF 中IL-1β、IL-8、TNF-α 比較(±s,n=8)Note. Compared with 3 h group, ##P＜0.01. Compared with 6 h group, △P＜0.05, △△P＜0.01. (The same in the following figures)Figure 4 Comparison of IL-1 β,IL-8 and TNF-α in BALF(±s,n=8)

2.7 肺組織中MDA、SOD 含量

3 h 組與正常組比較,MDA 含量顯著升高(P＜0.01),SOD 含量顯著降低(P＜0.01),6 h 組與正常組比較,MDA 含量明顯升高(P＜0.05),SOD 明顯降低(P＜0.01),12 h 組與正常組比較,MDA 含量顯著升高,SOD 顯著降低(P＜0.01)。模型組組間比較,3 h 組與6 h 組比較,MDA 含量和SOD 含量具備差異(P＜0.05,P＜0.01),3 h 組與12 h 組比較,差異不顯著(P＞0.05),6 h 組與12 h 組比較,6 h組MDA 含量和SOD 含量具備顯著差異(P＜0.05,P＜0.01)(圖5)。

圖5 肺組織中MDA 和SOD 比較(±s,n=8)Figure 5 Comparison of MDA and SOD in lung tissue(±s,n=8)

2.8 HE 染色

正常組大鼠HE 染色顯示肺泡完整且大小均勻,無明顯炎性細(xì)胞浸潤。3 h 組、6 h 組和12 h 組均可見不同程度的急性肺部炎癥。3 h 組主要表現(xiàn)為肺泡隔增厚,肺泡壁塌陷,肺實(shí)質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤,間質(zhì)水腫、紅細(xì)胞滲出;6 h 組可見肺泡壁增厚,炎性細(xì)胞浸潤,紅細(xì)胞滲出;12 h 組肺泡壁增厚,肺泡壁塌陷,炎性細(xì)胞浸潤明顯。三組比較,3 h組肺部損傷最典型(圖6)。

3 討論

急性肺損傷是一種常見疾病,臨床表現(xiàn)為肺水腫、肺出血、患者呼吸功能下降為主要特征的肺部炎性疾病。引起ALI 的病因有很多,包括休克[18]、膿毒癥[19]、肺挫傷[20]、肺炎[21]、輸血[22]、急性胰腺炎[23]等直接因素,以及呼吸機(jī)誘導(dǎo)[24]、機(jī)械傷害[25]等間接因素均可導(dǎo)致ALI。從分子機(jī)制上分析,主要是蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激造成細(xì)胞凋亡,整個(gè)疾病過程中多種促炎細(xì)胞因子的過度釋放,遷移因子和炎性介質(zhì)過表達(dá),造成級(jí)聯(lián)式的免疫應(yīng)激反應(yīng)[26],誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴,疾病發(fā)展迅速,嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[27]。關(guān)于ALI 發(fā)病機(jī)制的研究幾十年來從未間斷,但其中細(xì)胞分子機(jī)制仍有待我們進(jìn)一步挖掘,制備穩(wěn)定可靠的ALI 動(dòng)物模型是探究ALI 發(fā)病機(jī)制的重要保證。

圖6 肺組織不同時(shí)間段病理學(xué)變化(HE 染色,× 400)Figure 6 Pathological changes in different time periods(HE staining, × 400)

目前制備ALI 模型應(yīng)用最廣泛的是氣管滴注法,分為暴露法和非暴露法。LPS 作為內(nèi)毒素主要成分,是造成ALI 重要起病因子[28]。本實(shí)驗(yàn)造模方法基于參考文獻(xiàn)結(jié)合課題組前期研究基礎(chǔ)上改良[17,29],采用暴露式氣管滴注LPS 法制備ALI 大鼠模型,施術(shù)者延頸部正中線切開暴露氣管后,可以直接觀察到注射針頭插入氣管內(nèi),有效的保證LPS通過氣管進(jìn)入肺腔,同時(shí)能更好的控制藥量,保證造模的成功率,研究發(fā)現(xiàn)暴露氣管滴注法要優(yōu)于非暴露式氣管滴注法[30]。

參照2011年美國胸科學(xué)會(huì)評(píng)定動(dòng)物急性肺損傷官方報(bào)告[31]制定模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),在LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠模型制備成功后對(duì)各組模型進(jìn)行評(píng)判。大鼠在氣管滴注LPS 后出現(xiàn)肺功能明顯下降,肺濕干重比值增加,表明肺水腫形成,病理切片顯示肺組織呈現(xiàn)肺損傷的特征,包括肺泡間隔增厚、肺泡壁塌陷、炎性細(xì)胞浸潤、肺間質(zhì)水腫和出血。BALF 中炎性因子檢測(cè)IL-1β、IL-8、TNF-α 含量上升顯著,提示大鼠肺內(nèi)炎癥反應(yīng)劇烈,肺組織中MDA 的上升和SOD 的下降,表明肺部的氧化和抗氧化機(jī)制的失衡,以上指標(biāo)趨勢(shì)均符合2011年美國胸科學(xué)會(huì)評(píng)定動(dòng)物急性肺損傷官方報(bào)告[31]對(duì)ALI 動(dòng)物評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),表明本次實(shí)驗(yàn)復(fù)制ALI 大鼠模型成功,且結(jié)果表明3 h 組造模效果要優(yōu)于6 h 組、12 h 組。

從組織學(xué)的角度來看,肺是一個(gè)非常復(fù)雜的器官。肺上皮由兩種主要細(xì)胞類型組成,肺泡Ⅰ型(alveolar type I,ATI)細(xì)胞和肺泡Ⅱ型(alveolar type II,ATII)細(xì)胞,又稱I 型和II 型肺泡細(xì)胞。ATI 與ATII 細(xì)胞共同構(gòu)成肺外周部完整的上皮襯里,在肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[32]。肺泡上皮是保護(hù)肺部免受外界環(huán)境傷害的機(jī)械屏障,它積極參與肺部的免疫反應(yīng),有助于維持肺泡表面液體平衡[33]。急性肺損傷病理學(xué)表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞損傷、大量中性粒細(xì)胞在肺中聚集以及彌漫性的肺水腫。在LPS的誘導(dǎo)下,肺上皮細(xì)胞損傷、凋亡,釋放大量的促炎因子和趨化因子,從外周血液中招募大量的中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺中,中性粒細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎性介質(zhì)和趨化因子,造成炎癥級(jí)聯(lián)式反應(yīng),引起細(xì)胞因子風(fēng)暴產(chǎn)生[34]。另外肺泡上皮屏障被破壞,使得血管內(nèi)大量富含蛋白質(zhì)的液體進(jìn)入肺泡,造成彌漫性肺水腫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,氣管內(nèi)灌注LPS 誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷,中性粒細(xì)胞浸潤,彌漫性肺水腫,成功建立ALI 大鼠模型。

肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages,AM)是支氣管肺泡內(nèi)主要的常駐免疫細(xì)胞,它與肺泡上皮細(xì)胞一起,對(duì)到達(dá)下呼吸道的有毒物質(zhì)和病原體產(chǎn)生即時(shí)反應(yīng),有助于維持肺內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[35]。AM 在接受不同刺激物誘導(dǎo)后,可經(jīng)典活化為M1 型肺泡巨噬細(xì)胞和M2 型肺泡巨噬細(xì)胞。M1 主要分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎;M2 主要分泌細(xì)胞因子IL-10,TGF-β 等發(fā)揮抗炎作用[36]。LPS 屬于經(jīng)典的巨噬細(xì)胞激活劑[37]。AM 對(duì)LPS 的反應(yīng)和隨后細(xì)胞因子的釋放依賴于Toll 樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)[38]。通常AM 中TLR4 的表達(dá)量很低,但在LPS 暴露后TLR4 的表達(dá)迅速增強(qiáng)[39]。LPS 與TLR4 受體結(jié)合,導(dǎo)致促炎通路NF-κB(nuclear factor-kappa B)活化,產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6,最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和急性肺損傷的臨床表現(xiàn)[40]。此外,氣管內(nèi)注射LPS 可誘導(dǎo)壞死性AM 釋放IL-1α,繼而激活內(nèi)皮細(xì)胞,增加血管通透性,造成肺間質(zhì)水腫[41]。實(shí)驗(yàn)中,暴露式氣管灌注LPS 法主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)水腫,也從側(cè)面佐證了這一點(diǎn)。

本研究表明,通過暴露式氣管滴注LPS 法成功復(fù)制ALI 大鼠模型,同時(shí)針對(duì)3 h 這一時(shí)段,暴露式氣管滴注LPS 法能更好的反映急性肺損傷這一疾病的病理特性。