師朗 宋志霞，2 張雅飛

1三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌 443003； 2宜昌市中心人民醫(yī)院腎內(nèi)科 443003

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病病程發(fā)展中的一種破壞性微血管的并發(fā)癥，其發(fā)病特征以持續(xù)性蛋白尿、腎小球?yàn)V過率受損及腎功能進(jìn)行性下降為主[1]。相關(guān)研究表明終末期腎病病因中DN占比高達(dá)40%[2]。最近的一項(xiàng)研究表明，在北京和上海等大城市，慢性腎臟病病因分析中，糖尿病相關(guān)性腎臟病所占比例超過了腎小球腎炎[3]。目前，臨床上對DN的發(fā)生和發(fā)展尚無特效措施，仍有大量患者進(jìn)展為終末期腎病，給患者及社會(huì)造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，深入探究DN的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)相關(guān)預(yù)防或延緩DN進(jìn)展的治療策略十分重要。

DN發(fā)生發(fā)展的機(jī)制截至目前尚未完全闡明，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為與腎小球?yàn)V過屏障受損嚴(yán)重程度有關(guān)[4]。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，位于腎小球基底膜的外側(cè)[5]。我們課題組及其他學(xué)者的研究證實(shí)，足細(xì)胞損傷可能是促進(jìn)DN的發(fā)生和發(fā)展的重要原因[6-7]。由于足細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，幾乎無再生能力，因此，細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)對維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定就顯得尤為重要。自噬是細(xì)胞降解異常細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)過程的統(tǒng)稱，其作為細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)，是一種保守的穩(wěn)態(tài)過程，在各種條件下對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[8]。早期研究表明，自噬與多種代謝性疾病相關(guān)，且在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的糖脂代謝中發(fā)揮重要作用[9]。最近研究表明，自噬異常亦與足細(xì)胞損傷有關(guān)，可能是DN大量蛋白尿的重要機(jī)制[10-11]。

二氫歐山芹(columbianetin，CBT)屬于呋喃香豆素類化合物，最早從中藥材獨(dú)活中分離出來的[12]。目前已證實(shí)CBT廣泛存在于獨(dú)活、當(dāng)歸等多種藥用植物中，且在獨(dú)活中的含量較多，是其主要質(zhì)量控制成分[13-14]。藥理研究表明CBT具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等作用[15]。另外，CBT被證明具有抑制巨噬細(xì)胞活化，穩(wěn)定肺泡巨噬細(xì)胞的分離，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和壞死等作用[16]。CBT還可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素的RNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)足細(xì)胞中細(xì)胞色素蛋白的釋放參與了足細(xì)胞損傷[17-18]。由此可以看出 CBT在疾病治療中起重要作用，且對足細(xì)胞的損傷有一定作用，但目前CBT與DN的相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究擬探討CBT對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷是否有保護(hù)作用，其機(jī)制是否與調(diào)節(jié)自噬有關(guān)。

材料與方法

一、材料

小鼠永生系足細(xì)胞MPC5由上海酶研科技有限公司提供。二氫歐山芹購自北京百奧萊博科技有限公司。

胎牛血清(北京百奧萊博科技有限公司)；RPMI-1640 培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)?？贵wNephrin、Podocin、Beclin-1、Desmin、P62、p-JNK(CST公司，美國)；羊抗兔二抗(Santa Cruz公司，美國)。GFP-LC3-Ⅱ質(zhì)粒(賽默飛科技中國有限公司)，TLR4 siRNA(sc-156001)、control siRNA、SP600125(sc-200635)及轉(zhuǎn)染試劑購自Santa Cruz公司。

二、方法

1.足細(xì)胞培養(yǎng) 將永生性小鼠足細(xì)胞系MPC-5在含有10% FBS和100 U/mL IFN-γ的PMI-1640培養(yǎng)基中在33℃，5% CO2條件下培養(yǎng)增殖，然后在37℃，5% CO2條件下在無IFN-γ的RPMI-1640中孵育14 d，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

2.蛋白質(zhì)印跡法 MPC-5細(xì)胞在冷RIPA緩沖液中裂解，用10%SDS-PAGE分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)。再用含5%脫脂奶粉的磷酸緩沖鹽溶液在4°C孵育3 h，4°C與所用一抗孵育過夜，再與熒光標(biāo)記的二抗在37°C孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測并采用Image-Pro plus軟件(Media Controbernetics Inc，Rockville，MD)分析相關(guān)蛋白的表達(dá)，選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為內(nèi)參照。

3.免疫熒光 吸取100 μL細(xì)胞懸液加至6孔板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將足細(xì)胞傳代種植于96孔板上，細(xì)胞貼壁融合達(dá) 60%后，以DMEM培養(yǎng)基孵育，以脂質(zhì)體Lip 2000轉(zhuǎn)染 GFP-LC3-Ⅱ質(zhì)粒，按照說明書每孔加入4 g/mL 濃度的 GFP-LC3-Ⅱ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 6 h 后，更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后分別予以 5.0 mmol/L、30.0 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)48 h后，在熒光顯微鏡下觀察足細(xì)胞自噬情況。

4.siRNA轉(zhuǎn)染 用脂質(zhì)體Lip2000將TLR4 siRNA導(dǎo)入足細(xì)胞中，具體操作步驟按Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞均勻地接種在6孔板上，培養(yǎng)過夜后細(xì)胞融合達(dá)60%，換為Opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。TLR4 siRNA與Lipo 2000的稀釋液混勻后常溫靜置20 min，加入孔板中，4 h后加入DMEM培養(yǎng)液、無關(guān)片段轉(zhuǎn)染復(fù)合物或TLR4 siRNA(40 nmol/L)轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染后48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以Mean±SD表示，多組之間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷及自噬水平下降

首先把足細(xì)胞分為正常濃度組：NG(5 mmol/L)、高糖組：HG(30 mmol/L)和甘露醇滲透壓對照組：NG+M(5 mmol/L+25 mmol/L)進(jìn)行處理，然后采用蛋白質(zhì)印跡法檢測及定量分析Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1、P62等相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常濃度組相比，甘露醇滲透壓對照組相關(guān)檢測蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而高糖組Nephrin、Podocin表達(dá)顯著下降，Desmin表達(dá)升高，說明高糖刺激足細(xì)胞引起足細(xì)胞損傷。而P62表達(dá)明顯增高、Beclin-1表達(dá)則顯著下降，表明高糖可抑制足細(xì)胞自噬。(圖1)

二、2.2 CBT 對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷及自噬的影響

為了探討CBT對足細(xì)胞損傷及自噬的影響，首先設(shè)定天然提取物CBT濃度梯度為0.5μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，80 μg/mL，以Beclin-1為觀察指標(biāo)，觀察到自噬增強(qiáng)較為明顯的濃度為20 μg/mL，且20～80 μg/mL之間無明顯差異，固選用20 μg/mL為實(shí)驗(yàn)濃度(圖2A、2B)。然后把足細(xì)胞分為正常濃度組：NG(5 mmol/L)、高糖組：HG(30 mmol/L)和CBT組：HG+CBT(30 mmol/L+20 μg/mL)進(jìn)行處理，再采用蛋白質(zhì)印跡法檢測及定量分析結(jié)果顯示與高糖組相比，CBT處理后足細(xì)胞Nephrin、Podocin蛋白表達(dá)顯著升高，Desmin蛋白表達(dá)下降，表明CBT可抑制足細(xì)胞損傷。同時(shí)P62蛋白表達(dá)下降、Beclin-1表達(dá)升高，表明 CBT可誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬。(圖2C、2D)

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；M：甘露醇；αP<0.05，bP>0.05。圖1 NG、NG+M和HG各組足細(xì)胞相關(guān)蛋白、損傷標(biāo)志物和自噬相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá) 1A.足細(xì)胞Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1和P62蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；1B、1C.圖1A定量分析

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；CBT：二氫歐山芹；aP<0.05，bP>0.05。圖2 NG、HG和HG+CBT各組足細(xì)胞相關(guān)蛋白、損傷標(biāo)志物和自噬相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá) 2A.不同濃度CBT組Beclin-1蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法印跡)；2B.圖2A定量分析；2C.足細(xì)胞Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1和P62蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；2D、2E.圖2C定量分析

三、CBT可上調(diào)TLR4、P-JNK的表達(dá)

已有研究證實(shí)，TLR4在糖尿病患者高糖誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。本研究檢測了CBT對足細(xì)胞內(nèi)TLR4表達(dá)及p-JNK磷酸化水平的影響。結(jié)果顯示，與正常濃度葡萄糖組相比，CBT可顯著促進(jìn)足細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白表達(dá)以及p-JNK蛋白磷酸化激活。說明CBT可通過TLR4/ P-JNK信號通路發(fā)出信號。(圖3)

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；CBT：二氫歐山芹；aP<0.05。圖3 NG、HG和HG+CBT各組TLR4及p-JNK蛋白的表達(dá) 3A.足細(xì)胞TLR4及p-JNK蛋白的表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；3B.圖3A定量分析

四、siRNA TLR4阻斷CBT的保護(hù)作用

TLR4 siRNA抑制TLR4表達(dá)同時(shí)可抑制的p-JNK蛋白激活(圖4A、4B)。按預(yù)設(shè)分組處理足細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測及定量分析Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1、P62等相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，相比于CBT組，加入TLR4 siRNA(40 nmol/L)能使Nephrin、Podocin表達(dá)顯著下降，Desmin表達(dá)升高，說明TLR4 siRNA能夠有效地阻斷CBT對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。同時(shí)P62蛋白表達(dá)升高、Beclin-1表達(dá)下降，表明TLR4 siRNA也阻斷了CBT誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬的作用(圖4C、4E)。

五、JNK抑制劑SP600125阻斷CBT的保護(hù)作用

為了進(jìn)一步探討TLR4/p-JNK信號通路對CBT保護(hù)足細(xì)胞的影響，我們加用JNK酶特異性抑制劑SP600125(10 μmol)。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測及定量分析Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1、P62 等相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示SP600125亦阻斷了CBT對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，足細(xì)胞中Nephrin、Podocin及Beclin-1蛋白表達(dá)顯著下降，同時(shí)Desmin及P62蛋白表達(dá)顯著增高，該結(jié)果提示CBT通過TLR4/p-JNK調(diào)節(jié)自噬，進(jìn)而改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。(圖5)

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；CBT：二氫歐山芹;aP<0.05。圖4 NG、HG、HG+CBT和HG+CBT+TLRsiRNA各組足細(xì)胞相關(guān)蛋白、損傷標(biāo)志物、自噬相關(guān)標(biāo)記物及TLR4等蛋白的表達(dá) 4A.對照組及TLR4沉默組TLR4和p-JNK蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；4B.圖4A定量分析；4C.足細(xì)胞Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1和P62蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；4D、4E.圖4C定量分析

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；CBT：二氫歐山芹;aP<0.05。圖5 NG、HG、HG+CBT和HG+CBT+SP600125各組足細(xì)胞相關(guān)蛋白、損傷標(biāo)志物及自噬相關(guān)標(biāo)記物蛋白的表達(dá) 5A.足細(xì)胞Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1和P62蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；5B、5C.圖5A定量分析

六、實(shí)驗(yàn)各組LC3-Ⅱ的表達(dá)情況

LC3-Ⅱ是自噬體標(biāo)記物。我們進(jìn)一步使用熒光顯微鏡觀察GFP-LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞染色熒光顆粒情況，結(jié)果顯示高糖可以明顯抑制足細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ的熒光強(qiáng)度，提示高糖抑制足細(xì)胞自噬。而CBT能夠促進(jìn)足細(xì)胞自噬發(fā)生，起到細(xì)胞保護(hù)作用。與CBT組相比，TLR4 siRNA及SP600125組中足細(xì)胞的LC3-Ⅱ熒光顆粒數(shù)目明顯減少，強(qiáng)度減弱明顯，表明CBT通過TLR4、p-JNK途徑誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬。(圖6)

圖6 各組足細(xì)胞內(nèi)和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)(免疫熒光 40×)

討 論

DN是世界范圍內(nèi)最重要的健康問題之一，并且在未來幾十年內(nèi)持續(xù)惡化[19]。研究表明足細(xì)胞在蛋白尿的發(fā)病機(jī)制和DN的進(jìn)展中起重要作用[20]。DN進(jìn)展過程中的高血糖往往導(dǎo)致足細(xì)胞損傷、脫落、數(shù)目下降，進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白尿的形成，其中足細(xì)胞損傷是蛋白尿的主要標(biāo)志[21]。足細(xì)胞由Nephrin和Podocin等裂孔隔膜蛋白連接，組成腎小球?yàn)V過蛋白質(zhì)和其他大分子物質(zhì)的主要屏障[22]。有研究證實(shí)當(dāng)Nephrin基因表達(dá)發(fā)生變化時(shí)，腎濾過膜結(jié)構(gòu)和屏障功能的完整性受到影響，最終導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[23]。Desmin 蛋白在機(jī)體正常時(shí)并不表達(dá)，而當(dāng)腎小球足細(xì)胞嚴(yán)重受損時(shí)可大量表達(dá)[24]。另外有研究證明蛋白尿與足細(xì)胞特異性蛋白Nephrin和Podocin的減少有關(guān)，Nephrin、Podocin及其mRNA表達(dá)隨足細(xì)胞損傷而降低[25]?？梢奛ephrin、Podocin及Desmin等相關(guān)蛋白的表達(dá)與DN蛋白尿形成密切相關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)，高糖組小鼠足細(xì)胞內(nèi)Nephrin、Podocin表達(dá)顯著下降，Desmin表達(dá)顯著升高，提示高糖可引起足細(xì)胞損傷，這一結(jié)果與以上研究一致。

細(xì)胞自噬在細(xì)胞維持自身代謝需要和某些細(xì)胞器更新等過程中起著核心作用，對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[8]。已有大量研究證實(shí)自噬異常與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)。在阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型中，自噬活化可以抑制足細(xì)胞的損傷，而在足細(xì)胞特異性敲除Atg7的小鼠足細(xì)胞損傷加重，該研究結(jié)果證實(shí)自噬在減輕足細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用[26]，亦有研究在DN中模型中觀察到自噬活性能夠減輕DN尤其足細(xì)胞損傷[27]。我們課題組前期在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DN大鼠模型中發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白Nephrin與自噬相關(guān)蛋白Beclin-1呈正相關(guān)，給予活性維生素D3干預(yù)后可上調(diào)自噬的表達(dá)，同時(shí)減輕了足細(xì)胞損傷[11]。研究證實(shí)，足細(xì)胞受損時(shí)自發(fā)引起的自噬活化與多種分子機(jī)制相關(guān)，其中Beclin-1是早期被確定的自噬相關(guān)蛋白，目前作為監(jiān)測自噬的標(biāo)記被廣泛應(yīng)用，Beclin-1的表達(dá)水平在一定程度上代表了自噬活性[28]。細(xì)胞內(nèi) LC3-Ⅱ 水平是檢測自噬的另一標(biāo)志物[29]。當(dāng)細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，P62可與定位在自噬體上的LC3-Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，最終在自溶酶體中降解，自噬不足時(shí)，P62 降解被抑制，現(xiàn)已用作檢測自噬降低的標(biāo)志[30]。在本研究中，我們測定了Beclin-1，P62及 LC3-Ⅱ的表達(dá)，以確定高糖對足細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖處理的足細(xì)胞中P62表達(dá)顯著增多而Beclin-1表達(dá)明顯減少，這一結(jié)果提示足細(xì)胞損傷可激活足細(xì)胞自噬，但高糖明顯抑制了其自噬活性，這一結(jié)果與上述研究一致。

CBT是一種存在于多種中藥中的天然香豆素類化合物，已被證明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等多種藥理作用[13，15]。本研究在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)上，探討了CBT對足細(xì)胞自噬和腎臟保護(hù)的影響及其潛在分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBT對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷具有顯著抑制作用，同時(shí)CBT處理后足細(xì)胞中Nephrin、Podocin表達(dá)顯著升高而Desmin表達(dá)下降，表明CBT明顯可抑制足細(xì)胞損傷，而P62蛋白表達(dá)下降、Beclin-1表達(dá)升高，LC3-Ⅱ熒光標(biāo)記蛋白增多等結(jié)果提示CBT可誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬，保護(hù)腎臟受損。

Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR4)屬于受體家族，是參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的參與識別受體[31]。有研究表明，TLR4信號傳導(dǎo)與自噬有關(guān)[32]。也有研究表明高糖可激活間質(zhì)細(xì)胞中的TLR4，且TLR4在糖尿病患者高糖誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[33]。另外，在胰島β細(xì)胞中，可通過調(diào)控脂毒性的TLR-4通路實(shí)現(xiàn)拮抗高糖高脂毒性[34]。本研究結(jié)果顯示CBT可顯著促進(jìn)TLR4蛋白表達(dá)，同時(shí)TLRsiRNA和抑制劑SP600125具有相同的作用結(jié)果，即均可下調(diào)Beclin-1、Nephrin、等蛋白表達(dá)同時(shí)上調(diào)Desmin及P62蛋白表達(dá)，表明其可抑制CBT 作用活性，抑制足細(xì)胞自噬。JNK是絲裂原活化蛋白激酶的一個(gè)重要分支，其在細(xì)胞凋亡及臟器細(xì)胞受損等過程中起重要作用[35]。本研究結(jié)果顯示TLRsiRNA可顯著抑制 p-JNK蛋白表達(dá)，提示CBT可通過誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬對DN的保護(hù)作用，而這一過程可能是通過磷酸化JNK信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，CBT可誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬，抑制足細(xì)胞損傷，進(jìn)而減輕腎臟受損，這一過程可能是通過磷酸化JNK信號通路實(shí)現(xiàn)的。我們的研究結(jié)果初步為CBT成為治療DN潛在藥物提供了證據(jù)，后續(xù)還需要做更多的研究探索CBT更深層次的作用機(jī)制

利益沖突作者沒有利益沖突需要聲明