蔣志濤，呂玲燕，韓 怡，倪 磊

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院藥學(xué)部，張家港 215600

阿司匹林抗血小板功效顯著，常用于心血管疾病（cardiovascular disease，CVDs）的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防。從20 世紀(jì)90 年代以來(lái)，臨床上出現(xiàn)有部分患者使用阿司匹林后并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期治療效果，稱(chēng)之為“阿司匹林抵抗”（aspirin resistance，AR）[1]。鑒于阿司匹林是改善患者CVD 結(jié)局干預(yù)措施的關(guān)鍵物質(zhì)，有發(fā)生CVD 事件風(fēng)險(xiǎn)的患者如果出現(xiàn)AR 就是重要的臨床問(wèn)題。同時(shí)AR 患者的心血管事件發(fā)生率和死亡率顯著增加，Gum PA 等[2]研究了326 例使用阿司匹林的穩(wěn)定性CVD 患者，其中有17 例（5.2%）出現(xiàn)AR，平均隨訪1.9 年后，AR 患者的復(fù)合終點(diǎn)（死亡、心肌梗死或腦卒中）發(fā)生率為24%，顯著高于其余患者的10%。目前尚不完全清楚AR產(chǎn)生的機(jī)制，研究顯示，其主要的影響因素包括用藥依從性差、阿司匹林藥代動(dòng)力學(xué)變化、與其他藥物相互作用、血小板活性上調(diào)、非血小板COX-1 來(lái)源的血栓素A2 生成增多、藥物治療靶點(diǎn)變化等[3]。

現(xiàn)有的AR 治療措施主要為調(diào)整藥物劑量、服藥時(shí)間、控制基礎(chǔ)疾病等，臨床效果并不顯著。中醫(yī)藥干預(yù)AR 治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。馬衛(wèi)琴等[4]研究了87 例AR 患者的體質(zhì)類(lèi)型，其中以血瘀、氣虛體質(zhì)較為常見(jiàn)。陳光等[5]研究多項(xiàng)中醫(yī)藥臨床干預(yù)AR，結(jié)果顯示血瘀既是AR 的病因，也是AR 的病理產(chǎn)物，血瘀證與AR 緊密相關(guān)。還有研究表明，AR 最終將導(dǎo)致血瘀證的出現(xiàn)[6]。本研究運(yùn)用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)尋找AR相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，為后期深入探討“藥物改善AR 的作用機(jī)理”打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC TM 型超高效液相色譜儀和Xevo G2-XS 型飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國(guó)Waters 公司）；AE240 電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 藥物與試劑

阿司匹林腸溶片（拜阿司匹林，批號(hào)BJ40031，拜耳醫(yī)藥保健公司）；布洛芬緩釋膠囊（芬必得，批號(hào)18010587，中美天津史克公司）；硫糖鋁咀嚼片（批號(hào)227004，重慶科瑞制藥）；乙腈、甲酸、甲醇為色譜純；醋酸銨為分析純；超純水。

1.3 動(dòng)物

雄性金黃地鼠（SPF 級(jí)）80 只，6～8 周齡，體重120～140 g，購(gòu)于南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 金黃地鼠分組及AR 模型建立

參考唐世英等[7]金黃地鼠高脂血癥動(dòng)物模型研究，將金黃地鼠隨機(jī)分為空白組（A 組，n=12）、阿司匹林抵抗模型組（B 組，n=12）。A 組自由餐食飲水；B 組給予飼料（高脂高鹽高糖）喂養(yǎng)12 周。具體造模方式為：第9 周開(kāi)始每天早上8 時(shí)給予B 組金黃地鼠硫糖鋁（14.8 g·kg-1）灌胃一次，下午1 點(diǎn)給予B 組阿司匹林（0.74 g·kg-1）和布洛芬（2.22 g·kg-1）混合灌胃一次，藥物劑量隨金黃地鼠體重變化而每1 周調(diào)整一次。同時(shí)第9 周開(kāi)始每天下午4 時(shí)將B 組金黃地鼠置于10 m2密閉實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，點(diǎn)燃香煙15 支，持續(xù)30 min。

模型判斷標(biāo)準(zhǔn)：B 組金黃地鼠第12 周禁食12 h后，于腹主動(dòng)脈取血進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果：甘油三酯＞0.8 mmol·L-1、血清總膽固醇＞1.6 mmol·L-1，表明高脂血癥模型成功。該金黃地鼠再進(jìn)行血小板聚集檢測(cè)[8]，其中血小板平均聚集率既符合腺苷二磷酸鈉鹽誘導(dǎo)下≥70%，又符合花生四烯酸誘導(dǎo)下≥20%，則認(rèn)為其屬于AR 造模成功。

2.2 血清樣本采集與處理

采用腹主動(dòng)脈取血法。為了減少采血對(duì)金黃地鼠體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，采集空腹血樣進(jìn)行代謝組學(xué)分析。采血方法為：第12 周末，將所有金黃地鼠禁食12 h，10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔麻醉，仰臥位固定，開(kāi)腹主動(dòng)脈取血4 mL，以2 mL 全血供血小板聚集檢測(cè)，2 mL 置于醫(yī)用血清管中，3000 r·min-1離心20 min，取上層血清于-70 ℃保存，供UPLC-Q-TOF-MS 分析。

分析前于室溫下解凍血清，渦旋30 s，取200 μL 樣品加入1.5 mL EP 管中，而后加入800 μL 預(yù)冷的甲醇（4 ℃），渦旋30 s 后，4 ℃下12000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，放置于離心濃縮儀35 ℃離心揮干，50%甲醇100 μL 復(fù)溶，4 ℃下12000 r·min-1離心10 min，吸取50 μL 于進(jìn)樣小瓶中待測(cè)。

為保證分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，采用質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品進(jìn)行方法驗(yàn)證。QC 樣品是由每個(gè)樣品各取40 μL 復(fù)溶液混合而得，為降低誤差，樣品檢測(cè)為隨機(jī)進(jìn)行。在對(duì)樣品分析前，先運(yùn)行5 次QC 樣品以平衡系統(tǒng)，在檢測(cè)過(guò)程中，每檢測(cè)5個(gè)樣品后運(yùn)行1 次QC 樣品，以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.3 色譜條件

采用Acquity UPLCTM BEH C18色譜柱（2.1mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；流速：0.4 mL·min-1，采用梯度洗脫的方式運(yùn)行15 min。每次進(jìn)樣5μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)定4℃。正離子檢測(cè)：A 流動(dòng)相=99.9%乙腈、0.1%甲酸；B 流動(dòng)相=99.9%水、0.1%甲酸。負(fù)離子檢測(cè)：A 流動(dòng)相=90%乙腈、10%水，10 mmol 醋酸銨，氨水調(diào)節(jié)pH 至9；B 流動(dòng)相=5%乙腈、95%水，10 mmol 醋酸銨，氨水調(diào)節(jié)pH 至9。洗脫程序：0～0.5 min，3% B；0.5～1.5 min，3～20% B；1.5～6 min，20～60% B；6～9 min，60～95% B；9～12 min，95% B；12～12.1 min，95～3% B；12.1～15 min，3% B。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）采用正、負(fù)離子掃描模式，毛細(xì)管電壓3.0kV，錐孔電壓30V，碰撞能電壓6eV，離子源溫度120 ℃，除溶劑溫度350 ℃，除溶劑氣體流為700 L·h-1氮?dú)猓杉秶鷐/z 100～1000，碰撞氣體為氦氣。

質(zhì)譜正離子掃描，全掃描范圍m/z 70～1050。全掃描中選擇離子強(qiáng)度TOP15 的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜負(fù)離子掃描，全掃描范圍m/z 70～1050。全掃描中選擇離子強(qiáng)度TOP15 的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定。

2.5 系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測(cè)

運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS 代謝組學(xué)研究，穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)方法才能獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。每隔4 個(gè)樣品分析QC 樣品和空白樣品，以檢驗(yàn)分析方法的穩(wěn)定性和色譜上樣量。

2.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

獲取UPLC-Q-TOF-MS 指紋圖譜后，采用Analyst?TF 1.7 Software 導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，可以存儲(chǔ)到與每份樣品對(duì)應(yīng)的獨(dú)立的文件中，PeakView 將異常的峰去掉；Markview 進(jìn)行峰對(duì)齊。最終獲得包含質(zhì)荷比、保留時(shí)間和峰面積三維數(shù)據(jù)表，利用QC 樣品對(duì)所有峰進(jìn)行校正，將校正后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-P v13.0 和EZinfo 3.0 進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，以便篩選出變量。采用主成分分析（PCA）得分圖，直觀地表示組與組之間的差異，通過(guò)偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，篩選前后變化顯著的差異代謝物，使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間差異顯著性比較采用t 檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將找到的潛在差異代謝物在HMDB（human metabolome databatabase）、METLIN 和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索與確認(rèn)，得到最終匹配差異代謝物。

2.7 主成分分析

在正、負(fù)離子模式下，血清及QC 樣品PCA 得分圖見(jiàn)圖1。將經(jīng)過(guò)校正后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用PCA法研究阿司匹林抵抗血清代謝物譜圖模式變化，獲得三組血清樣本在空間上的分布情況。圖1 同一顏色代表相同癥狀研究組，相同顏色越集中說(shuō)明同一癥狀個(gè)體差異小，越分散表明個(gè)體差異大。PCA 結(jié)果表明，正、負(fù)離子模式下，QC 樣品的聚集狀況均良好，表明系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好。AR 組和對(duì)照組盡管有部分交叉重疊，但有一定的分離趨勢(shì)。

圖1 血清及QC 樣品正（A）、負(fù)（B）離子模式下的主成分分析得分圖

2.8 偏最小二乘法及置換檢驗(yàn)

為消除與研究目的無(wú)關(guān)的隨機(jī)誤差及組內(nèi)誤差，對(duì)UPLC-Q-TOF-MS 數(shù)據(jù)采用有監(jiān)督的PLS-DA方法再次進(jìn)行分析。PLS-DA 由PCA 演變而來(lái)的雙線性回歸模型，能夠忽略次要因素對(duì)結(jié)果的不利影響，提高判別分析的能力，有助于確定兩組間的差異成分，從而識(shí)別有效的標(biāo)志物，不同顏色符號(hào)在此種建模中分散的越開(kāi)，說(shuō)明兩組間的成分差異越顯著。本研究PLS-DA 得分圖見(jiàn)圖2，其顯示AR 組與對(duì)照組分離明顯，說(shuō)明兩組間存在一定差異。PLS-DA 正、負(fù)離子模式的模型參數(shù)分別為R2Y=0.929，Q2=0.435；R2Y=0.978，Q2=0.673；表明模型有效。進(jìn)一步對(duì)模型進(jìn)行響應(yīng)置換檢驗(yàn)，100 次隨機(jī)改變后建立對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)的PLS-DA 模型，以獲取模型的R2和Q2值。在兩種模式下，R2=0.932，Q2=0.201；R2=0.954，Q2=0.137；說(shuō)明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)健性良好。

2.9 差異代謝物的篩選[9]

本研究使用PLS-DA 模型中VIP 值參數(shù)，結(jié)合t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，篩選潛在的差異代謝物，VIP值是兩組中含量顯著改變的代謝物值，VIP 值＞1 并P＜0.05 時(shí)，顯示對(duì)應(yīng)的代謝物是差異性代謝物。針對(duì)組間的比對(duì)情況，在金黃地鼠不同組血清樣本中找到主要差異性代謝物，其中倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）代表不同組血清代謝物含量的比值，F(xiàn)C≥1.5 表明不同組血清中該代謝物質(zhì)相比正常組含量上升，表達(dá)為上調(diào)代謝物，F(xiàn)C≤2/3 表明不同組血清中該代謝物質(zhì)含量下降，表達(dá)為下調(diào)代謝物。通過(guò)搜索ChemSpide、MassBank、MetFrag 和Metlin等數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定差異代謝物。結(jié)果表明與對(duì)照組相比，AR 組有脫氧膽酸、硬脂酸、松香酸、谷氨酰胺、肌酸等11 個(gè)特異性代謝分子，其信息見(jiàn)表1。代謝物通路分析提示，與脂肪酸生物合成、二次膽汁酸生物合成、氨基酸代謝等密切相關(guān)。

圖2 對(duì)照組和AR 組正、負(fù)離子模式下最小二乘法判別分析

表1 主要差異代謝物信息

3 討論

AR 的病理生理過(guò)程十分復(fù)雜，目前其機(jī)制尚未闡明。代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，為從代謝的視角揭示AR 病理生理學(xué)過(guò)程的變化，以及它們包含的生物學(xué)意義提供了新的工具和方法。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)比較了AR 大鼠與正常大鼠血清化學(xué)成分的變化。模型組大鼠血清中含有各類(lèi)小分子代謝物，包括氨基酸、脂肪酸、膽汁酸等，且部分在含量上與對(duì)照組有明顯差異，這些物質(zhì)參與了多種生理生化過(guò)程，特別是脂代謝和膽汁酸代謝。

脫氧膽酸是膽酸失去一個(gè)氧原子衍生而得的一種游離膽汁酸，膽汁酸促進(jìn)脂類(lèi)物質(zhì)的消化與吸收，是體內(nèi)膽固醇的主要代謝去路，膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的代謝途徑異?？蓪?dǎo)致高膽固醇血癥，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。臨床研究證明，膽汁酸與血脂代謝紊亂、冠心病及腦血管疾病關(guān)系密切，有可能是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。

心肌在正常狀態(tài)下，脂肪酸氧化是其能量代謝的主要形式，心肌缺血缺氧時(shí)，脂肪酸代謝異常，表現(xiàn)為脂肪酸氧化減弱，中間產(chǎn)物堆積，心肌內(nèi)血清游離脂肪酸水平升高，其中硬脂酸是長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化的中間產(chǎn)物。模型組樣本中硬脂酸含量升高，提示AR 導(dǎo)致脂肪酸氧化速率下降，心肌能量代謝異常。

目前中醫(yī)藥干預(yù)AR 的研究主要集中于臨床研究，一些單味中藥（銀杏、丹參、三七等）及中成藥（復(fù)方丹參滴丸、通心絡(luò)膠囊、護(hù)心膠囊等）均報(bào)道對(duì)預(yù)防及治療AR 效果顯著，但機(jī)制研究較少。范英華等[11]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A 可有效抑制多種誘導(dǎo)劑（ADP、花生四烯酸等）誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集，并能顯著升高血小板中cAMP 的含量，其機(jī)制與cAMP多條GPCRs 信號(hào)通路有關(guān)。賴(lài)潤(rùn)民等[12]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液改善AR 機(jī)制涉及凝血過(guò)程、炎癥反應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)的21 條通路。

本研究顯示，AR 組有11 個(gè)差異代謝物：脫氧膽酸、硬脂酸、松香酸、谷氨酰胺、肌酸等，為AR 的潛在生物標(biāo)志物，提示AR 致病機(jī)理可能與脂肪酸生物合成、二次膽汁酸生物合成、氨基酸代謝有關(guān)，這為今后深入探討中藥改善AR 的作用機(jī)理提供理論數(shù)據(jù)。