楊 娜，劉紫薇，王 敏，朱懷軍，葛衛(wèi)紅**

1 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210008；2 中國藥科大學(xué)，南京 210009

性激素檢測是臨床實驗室檢測項目中公認的難題，主要原因是其在血液中含量極低（通常在pmol·L-1水平）[1]，且結(jié)構(gòu)類似物眾多[2]，因此對方法的敏感度和特異度要求很高。在現(xiàn)階段臨床檢測中免疫法多用于性激素的檢測；但由于其易受其他內(nèi)源性類固醇、脂質(zhì)和基質(zhì)效應(yīng)的干擾，對血清中微量性激素測定的特異性和可靠性仍然存在疑惑。

在性激素檢測中，雄激素、孕激素的檢測對于臨床包括多囊卵巢綜合征[3]、不孕癥[4]、高雄激素血癥[5]等諸多疾病的診斷具有重要意義。然而，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)免疫法用于高雄激素血癥的差錯率可高達1/3[3]。而質(zhì)譜法由于其高靈敏度和特異性的優(yōu)點，檢測具有較高的準確性。本研究旨在建立快速、靈敏度高、穩(wěn)定性好的UPLC-MS/MS 分析方法，用于同時檢測人血清中包括睪酮（testosterone，T）、雄烯二酮（androstenedione，AD）、脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）、孕酮（progesterone，P）和17α-羥孕酮（17-α-hydoxy progesterone，17α-OHP）等在內(nèi)的5 種內(nèi)源性激素。本方法為臨床血清樣本的檢測及相關(guān)疾病的診斷和研究提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 孕酮（P，純度99.7%，批號：G130207）、17α-羥孕酮（17α-OHP，純度99.5%，批號：G986202）、睪酮（T，純度99.2%，批號：G157843）、雄烯二酮（AD，純度99.3%，批號：G158946），均為德國DR.E 公司產(chǎn)品；脫氫表雄酮（DHEA，純度99.9%，批號：00004099-176,美國ChromaDex）；孕酮-d9[Pd9（IS），內(nèi)標，純度98%，批號：8-GBH-69-3，加拿大TRC 公司]；鹽酸羥胺（純度99%，上海麥克林生化科技有限公司）；叔丁基甲醚（阿拉丁公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；純化水。

1.1.2 主要儀器 ACQUITY UPLC I-Class/XEVO TQD 超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl 色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流動相：水相（A）：0.1%甲酸水，有機相（B）：乙腈（梯度洗脫程序：0.0～0.5min，40%B；0.5～3.0 min，40%～90%B；3.0～3.1 min，90%～40%B；3.1～5.0 min，40%B）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；整個運行時間：5 min；進樣體積5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；正離子模式掃描；多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓為3.5 kV；脫溶劑氣為氮氣，脫溶劑溫度為500 ℃，脫溶劑氣流速為850 L·h-1；錐孔氣流速為50 L·h-1；離子源溫度為150 ℃；碰撞氣為氬氣；儀器工作站為MassLynx（version4.1）。各種相關(guān)離子見表1。

表1 MRM 模式離子參數(shù)

1.2.3 儲備液和標準溶液配制 分別精密稱取T、AD、DHEA、P、17α-OHP 對照品和同位素標記的內(nèi)標P-d9（IS）粉末2 mg，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容至刻度，顛倒搖勻配制成終濃度為200 μg·mL-1的儲備液，-20 ℃儲存。分別取各類激素儲備液，依次用甲醇梯度稀釋，分別配制成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1的激素混合標準溶液。取內(nèi)標P-d9儲備液，用甲醇溶液逐級稀釋至10 ng·mL-1的內(nèi)標溶液。

鹽酸羥胺溶液的配制：精密稱取鹽酸羥胺適量，采用50%甲醇-水溶液（v/v），配制成濃度為100 mmol·L-1的鹽酸羥胺溶液，置于-20 ℃儲存。

1.2.4 空白血清的制備 取空白血清50 mL，按1%比例加入葡聚糖-活性炭，于37 ℃搖床振搖5 h 后4000 r·min-1離心15 min，得上清液于12000 r·min-1低溫超速離心20min，取上層澄清液，即為空白血清。

1.2.5 血清樣品的處理方法 取300 μL 血清樣本，加入20 μL P-d9內(nèi)標溶液（10 ng·mL-1）混勻，加入1.5 mL 甲基叔丁基醚溶液渦旋振蕩10 min，并在4 ℃下12000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上層有機相1.2 mL于真空濃縮裝置中，40 ℃揮干。加入100 μL 鹽酸羥胺溶液（100 mmol·L-1）于60 ℃水浴加熱30 min 作衍生化。取出在冰浴靜置，在4 ℃下12000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于進樣瓶中，以5 μL 進樣分析。

2 結(jié)果

2.1 分析方法優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 采用濃度為200 ng·mL-1的標準溶液，進行衍生化后，對T、AD、DHEA、P、17α-OHP 及內(nèi)標的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量進行逐一優(yōu)化和確認，得到最佳的錐孔電壓和碰撞能量。見表1。

通過對比峰強度，對離子源溫度、脫溶劑氣流量等進行逐步優(yōu)化，使目標化合物具有最高靈敏度。5 種激素經(jīng)衍生化處理后，極大提高了離子化效率，當進入質(zhì)譜均能產(chǎn)生響應(yīng)強度高且穩(wěn)定性好的[M+H]+分子離子峰。

2.1.2 液相條件優(yōu)化 分別采用甲醇和乙腈為有機相，進行梯度或等度洗脫條件的摸索，并對不同色譜柱的峰形進行對比考察。結(jié)果顯示，以“1.2.1”色譜條件進行梯度洗脫，5 種激素和內(nèi)標均顯示良好的峰形，且具有較高靈敏度。本法在UPLC 液相系統(tǒng)下，分析時間為5 min，能夠快速高效地分析目標雄激素和孕激素，達到較好的效果。

2.1.3 樣品處理優(yōu)化 采用葡聚糖-活性炭法能夠高效去除人血清中內(nèi)源性雌激素的干擾。血清樣本前處理摸索試驗發(fā)現(xiàn)蛋白沉淀法雜質(zhì)干擾多，基質(zhì)效應(yīng)較高。液-液萃取法中叔丁基甲醚萃取法具有較好的提取回收率，目標激素的提取回收率變異均能控制在15%以內(nèi)，并能保證較低的基質(zhì)干擾。此外，本實驗通過對衍生化的溫度、時間、試劑濃度等進行優(yōu)化，得到了理想的衍生化條件。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 特異性 按“1.2.5”項下方法處理空白血清樣本和加入各類激素對照品血清樣本，如圖1 所示。T、AD、DHEA、P、17α-OHP 和IS 的保留時間分別為2.04、1.99、1.92、2.55、1.98 和2.53 min。

圖1 UPLC-MS/MS 測定各激素及內(nèi)標的典型色譜圖

各待測物和內(nèi)標峰形良好，空白血清在各激素離子通道下無干擾，各激素在該方法下特異性良好。

2.2.2 標準曲線和定量下限 取空白血清270 μL，分別加入含T、AD、DHEA、P、17α-OHP 混合標準溶液30 μL，使其血清中濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng·mL-1，每個濃度3 個樣本。按“1.2.5”項下方法處理樣本，以檢測目標激素峰面積和內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標Y，血清中各激素濃度為橫坐標X（pg·mL-1），用加權(quán)最小二乘法計算回歸方程（權(quán)重1/X）。得到各激素的標準曲線方程：T，Y=5.3×10-3X+0.13（r=0.9998）；AD，Y=2.9×10-3X+0.081（r=0.9996）；DHEA，Y=5.0×10-4X+0.029（r=0.9994）；P，Y=1.7×10-3X-0.0085（r=0.9991）；17α-OHP，Y=1.3×10-3X+0.013（r=0.9998）。

各激素在0.05～100 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性，定量下限（LLOQ）均為50 pg·mL-1（S/N>10）。

2.2.3 精密度和準確度 取空白血清分別配制3 批含LLOQ，低、中、高濃度（0.05、0.1、2、80 ng·mL-1）的混合激素的血清樣品，每個濃度平行6 份，按照“1.2.5”項下方法處理樣本，分3 天連續(xù)檢測，計算日內(nèi)與日間精密度、準確度。由結(jié)果可知，精密度（RSD）與準確度（RE）均在15%以內(nèi)，符合生物樣本測定要求。見表2。

表2 精密度和準確度（n=6）

2.2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 配制含有終濃度為0.1、2、80 ng·mL-1混合激素的血清樣本各6 份，按“1.2.5”項下方法處理血清樣本，記錄各激素峰面積A1和內(nèi)標峰面積AIS1。另取空白血清，經(jīng)甲基叔丁基醚萃取后、加入各激素混合標準溶液和內(nèi)標溶液，處理后測得各激素峰面積A2和內(nèi)標峰面積AIS2。取各激素混合標準溶液加入內(nèi)標溶液后處理進樣，測得各類激素的峰面積A3和內(nèi)標峰面積AIS3。計算峰面積比值：f1=A1/AIS1，f2=A2/AIS2，求得同一濃度樣本的比值平均值（f2）mean。計算相對提取回收率=f1/（f2）mean，并計算內(nèi)標歸一化基質(zhì)因子=（A2/A3）/（AIS2/AIS3）及其RSD（%），結(jié)果見表3。

在5 種激素低、中、高濃度水平下，平均提取回收率在78.7%～106.8%，歸一化基質(zhì)因子在94.2～114.9。相對提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)因子的RSD均＜15%，符合生物樣本定量分析要求。

2.2.5 穩(wěn)定性 配制5 種激素低、中、高濃度（0.1、2、80 ng·mL-1）的血清樣本，分別置于室溫24 h、4 ℃自動進樣盤放置24 h、反復(fù)凍融3 次、-70 ℃冷凍保存1 個月，每種處置方式每個濃度平行6 份，比較測定樣本的精密度和準確度。結(jié)果顯示，低、中、高濃度的精密度（RSD）和準確度（RE）均在±15%內(nèi)，符合生物樣本測定要求。

表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

2.2.6 實際血清樣本分析 采用已建立的分析方法，對5 份血清樣本進行檢測，結(jié)果見表4。

表4 血清樣本的測定（ng·mL-1）

其中1、2 號樣本為2 名懷孕女性，年齡分別為29、31 歲；3～5 號樣本為3 名男性，年齡為24～36歲。由表4 可見，5 份血清樣本中均可檢測出不同濃度的T、AD、DHEA、P、17α-OHP，且存在明顯個體差異。以上表明，本方法適用于臨床血清樣本中關(guān)鍵雄激素和孕激素的同時測定。

3 討論

相比于免疫法，質(zhì)譜法用于類固醇激素的測定具有很大優(yōu)勢。自20 世紀70 年代以來，質(zhì)譜法被逐漸運用到類固醇激素的測定中[6]。其中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在激素測定領(lǐng)域的發(fā)展比液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法更早[7]。研究證明，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有更高的選擇性、靈敏度以及更加簡單的前處理過程。然而，由于類固醇激素的結(jié)構(gòu)特性，其在質(zhì)譜中的離子化效率很低，常采用衍生化技術(shù)對其結(jié)構(gòu)中的羥基、羰基等基團進行衍生化處理，以提高其在質(zhì)譜中的離子化效率。其中，?；苌Ｓ糜诖萍に氐臏y定[8]。

本研究通過鹽酸羥胺肟化處理，極大增加了T、AD、DHEA、P、17α-OHP 在質(zhì)譜中的離子化效率。該方法測定時間短（5 min），可同時定量5 種目標激素，且均為臨床檢測中用于腎上腺皮質(zhì)增生、生殖功能障礙、高雄激素血癥等疾病的關(guān)鍵檢測品種，故本方法具有重要的臨床應(yīng)用價值。

研究表明，包含雌激素、孕激素和雄激素的性激素代謝網(wǎng)絡(luò)是一個緊密關(guān)聯(lián)的整體，以膽固醇為前體，首先經(jīng)側(cè)鏈縮短生成21 碳的孕激素，進一步去側(cè)鏈代謝為19 碳的雄激素，再通過A 環(huán)芳香化生成18 碳雌激素。在腎上腺皮質(zhì)功能相關(guān)疾病的狀態(tài)下，孕激素和雄激素水平都顯示出很大的改變。高雄激素血癥被發(fā)現(xiàn)也可引起體內(nèi)孕激素、雌激素水平的變化，同時引起不孕癥的發(fā)生。傳統(tǒng)的免疫檢測法，受商品化試劑盒的影響，不能夠全面、準確地了解不同個體性激素代謝的整體輪廓，故不能很好地提供個體化診療和用藥服務(wù)。

本研究采用了UPLC-MS/MS 法結(jié)合衍生化技術(shù)建立了可快速、同時檢測人血清中T、AD、DHEA、P 和17α-OHP 等5 種關(guān)鍵微量雄激素和孕激素的方法，結(jié)合本研究之前所建立的雌激素網(wǎng)絡(luò)質(zhì)譜測定方法[9]，可對性激素代謝網(wǎng)絡(luò)的整體定量描繪提供精準的服務(wù)，在疾病診療、發(fā)病風險分析和激素補充治療的個體化策略制定中，具有一定的臨床應(yīng)用價值。