戴國梁，楊欣怡，陳閃閃，許美娟，居文政，鄒建東

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理科，南京 210029

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，目前CRC 的發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第4 位和第2 位。有研究顯示，至2035 年，所有國家的結(jié)腸癌和直腸癌的死亡人數(shù)預(yù)計將分別上升60.0%和71.5%[1]。當(dāng)前對CRC的研究大多集中在比傳統(tǒng)療法更簡便、有效的新療法上，新藥開發(fā)及其臨床實施可能對改善CRC 患者的整體生存率和生活質(zhì)量起到積極作用。慢性炎癥與CRC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，“炎癥-異常隱窩-腺瘤-癌癥”是結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌（colitis-associated cancer，CAC）發(fā)生的基本路徑[2]，炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者如得不到有效的治療，其30 年內(nèi)罹患CAC 的風(fēng)險要比正常人高20 倍[3]，這提示炎癥反應(yīng)在CAC 發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，控制“炎-癌轉(zhuǎn)化”對防治CAC 意義重大。

從中藥中篩選治療CAC 的有效藥物值得期待，大黃蟄蟲丸（Dahuang Zhechong Pill，DZP）是《金匱要略》經(jīng)典名方，由熟大黃、黃芩、甘草、桃仁、杏仁、芍藥、干地黃、干漆、虻蟲、水蛭、蠐螬及蟄蟲12 味中藥組成，是中醫(yī)臨床治療腫瘤的最常用方劑之一。研究表明，DZP 配合化療可以改善晚期胃癌癥狀，同時對胃腸道惡性腫瘤患者有益。

前期研究證實，大黃中的活性成分大黃素可以通過抑制血管內(nèi)皮素受體2（VEGFR2）降低結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞的增殖和遷移[4]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，桃仁與杏仁的提取物均能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[5]。黃芩中的活性成分黃芩苷可通過抑制c-Myc、下調(diào)SP1轉(zhuǎn)錄因子等多種機制誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[6]。因此，DZP 可能是治療結(jié)直腸癌的有效藥物。在本研究中，擬使用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉（AOM/DSS）誘導(dǎo)的CAC 模型小鼠，探究DZP 對CAC 的影響及其治療CAC 的作用機制。

1 材 料

1.1 儀器

MicroCL17R 高速低溫離心機（賽默飛世爾科技公司）；DMI3000B 光學(xué)顯微鏡（萊卡公司）；Axio Observer Z1 熒光顯微鏡（蔡司公司）；ELx800 酶標(biāo)儀、Mini Protean 電泳儀、轉(zhuǎn)印槽及電泳電源、Gel-Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)（均伯騰儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑

大黃蟄蟲丸（規(guī)格：3 g/丸，批號：17013622，北京同仁堂制藥廠）；偶氮甲烷（AOM，批號：SLBV4860，規(guī)格：25 mg/瓶，Sigma 公司）；雙琥珀酰亞胺辛二酸酯（DSS，批號：160110，規(guī)格：500 g/瓶，MP biomedicals 公司）；小鼠IL-1β ELISA 檢測試劑盒（批號：ab197742）、小鼠IL-18 ELISA 檢測試劑盒（批號：ab216165）、兔緊密連接相關(guān)蛋白Occludin 單克隆抗體（批號：ab216327）、兔閉鎖小帶蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）單克隆抗體（批號：ab221547）、兔IL-1β 單克隆抗體（批號：ab234437）、兔IL-18 單克隆抗體（批號：ab71495）、兔自噬相關(guān)蛋白LC3B 單克隆抗體（批號：ab192890）、兔Sequestosome 1（SQSTM1）單克隆抗體（批號：ab109012）、兔自噬相關(guān)蛋白5 同源物（ATG5）單克隆抗體（批號：ab109490），均購自Abcam 公司；兔甘油酸-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號：10494-1-AP）、辣根過氧化物（HRP）-山羊抗兔IGg（批號：SA00001-2）及FITC-山羊抗兔IGg（SA00003-2）均購自Proteintech 公司；3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（批號：P0203）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（批號：C1006）、蘇木精-伊紅（HE）染色液（批號：C0105M）及超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號：P0018M），均購自碧云天生物技術(shù)公司；其他試劑為分析純；去離子水。

1.3 動物

60 只SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，12 周，18～22g，購自北京華阜康生物科技公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（蘇）2018-0049。

2 方 法

2.1 CAC 模型小鼠的復(fù)制、分組與給藥

60 只SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機分為4 組：對照組、模型組、DZP 低劑量組（2 g·kg-1）、DZP 高劑量組（4 g·kg-1）；每組15 只。除對照組外，其余各組小鼠，給予單次10 mg·kg-1AOM 腹腔注射，1 周后聯(lián)合3 個循環(huán)DSS 喂飼（2%DSS 飲水1 周+正常飲水2 周為一個循環(huán)），建立AOM/DSS 誘導(dǎo)的CAC 模型小鼠。對照組同步腹腔注射等體積生理鹽水并正常飲水。第1 個DSS 喂飼循環(huán)結(jié)束后（開始造模2 周后），開始灌胃給予相應(yīng)藥物，對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，周期為8 周。在實驗周期中，記錄小鼠生存情況，并繪制各組小鼠的生存曲線，實驗周期結(jié)束后，取小鼠血液和結(jié)腸組織進(jìn)行相應(yīng)檢測。

2.2 ELISA

使用ELISA 試劑盒檢測小鼠血液中IL-1β 及IL-18 的水平。參閱此兩種試劑盒說明書，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同組的小鼠血清分別加入包被了抗IL-1β 或IL-18 抗體的96 孔板中，同時加入的還有不同濃度的對應(yīng)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)30 min 后加入顯色底物，之后加入反應(yīng)終止液。清洗后，將96 孔板置于酶標(biāo)儀中，450 nm波長處檢測吸光度值，根據(jù)IL-1β 及IL-18 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各小鼠血清中IL-1β 及IL-18 的水平。

2.3 HE 染色

各組小鼠結(jié)腸固定于10%福爾馬林，垂直切取一段放于一次性包埋框。以不同濃度乙醇進(jìn)行脫水。之后將各組小鼠結(jié)腸浸泡于二甲苯中20min。融化的石蠟浸泡結(jié)腸40min 后，更換石蠟，再次浸泡40min。將小鼠結(jié)腸包埋成蠟塊，小鼠結(jié)腸的橫截面朝下。使用切片機將含有小鼠結(jié)腸的蠟塊切成5 μm 的蠟片，獲得小鼠結(jié)腸切片。將小鼠結(jié)腸切片放入二甲苯中溶解石蠟，再使用從高到低濃度的乙醇進(jìn)行浸泡，最后將小鼠結(jié)腸切片置于去離子水中。

使用蘇木素染色液對小鼠結(jié)腸切片進(jìn)行染色，使用鹽酸-乙醇溶液分化后，常水沖洗20 min 返藍(lán)。在使用伊紅染色液染色后，對小鼠結(jié)腸切片進(jìn)行快速脫水并封片。封片后，使用普通光學(xué)顯微鏡對小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行拍照，對其進(jìn)行組織學(xué)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)為由輕到重以0～5 分評判（5 分=顯著性增加，3分=中度增加，1 分=輕度增加，0 分=正常）。根據(jù)以下參數(shù)進(jìn)行評判：隱窩萎縮（隱窩個數(shù)，隱窩底部與黏膜肌距離）；隱窩多形核白細(xì)胞浸潤量、單核細(xì)胞浸潤量；隱窩基底部及黏膜基層淋巴細(xì)胞。

2.4 免疫組織化學(xué)染色

同HE 染色中的步驟，獲得復(fù)水的小鼠結(jié)腸組織切片。之后使用3%的H2O2溶液孵育小鼠結(jié)腸組織以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS 緩沖液清洗小鼠結(jié)腸組織后，使用檸檬酸鹽緩沖液在95 ℃的水浴鍋中孵育小鼠結(jié)腸組織20 min，以修復(fù)小鼠結(jié)腸組織中的抗原。正常山羊血清孵育小鼠結(jié)腸組織20 min，將ATG5、IL-1β 和IL-18 抗體稀釋100 倍，4 ℃孵育小鼠結(jié)腸組織過夜。用稀釋后的HRP-山羊抗兔IGg（1∶200）在室溫孵育小鼠結(jié)腸組織2 h。PBS 清洗后，DAB 顯色液孵育組織以顯色。PBS 再次清洗后，使用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。將小鼠結(jié)腸脫水、透明后封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 免疫組織熒光染色

同HE 染色中的步驟，獲得復(fù)水的小鼠結(jié)腸組織切片。之后使用檸檬酸鹽緩沖液在95 ℃的水浴鍋中孵育小鼠結(jié)腸組織20 min，以修復(fù)小鼠結(jié)腸組織中的抗原。正常山羊血清孵育小鼠結(jié)腸組織20 min，將Occludin 和ZO-1 抗體稀釋100 倍，4 ℃孵育小鼠結(jié)腸組織過夜。用稀釋后的FITC-山羊抗兔IGg（1∶200）在室溫下孵育小鼠結(jié)腸組織2 h。PBS 清洗后，DAPI 染色液孵育小鼠結(jié)腸切片5 min，PBS 再次清洗后，甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 蛋白印跡

取小鼠結(jié)腸組織，按照其每100 mg 加入1 mL裂解液的比例，置于EP 管中。用均質(zhì)儀打碎組織，4 ℃裂解30 min，12000 r·min-1離心10 min 后取上清液，檢測小鼠結(jié)腸組織的蛋白濃度。制備蛋白印跡實驗樣品和SDS-PAGE 凝膠，各孔加樣量為50μg。電泳分離蛋白后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作。使用稀釋后的LC3B（1∶1000）、SQSTM1（1∶1000）及ATG5（1∶1000）抗體孵育PVDF 膜過夜。清洗后，使用稀釋后的HRP-山羊抗兔IGg（1∶10000）孵育PVDF 膜2 h。再次清洗后，使用凝膠成像系統(tǒng)對蛋白印跡進(jìn)行顯影，存儲圖片。

2.7 統(tǒng)計分析

免疫組織化學(xué)染色和免疫組織熒光染色的圖片應(yīng)用Image pro plus（美國，Media Cybernetics）軟件進(jìn)行計算平均光密度，并導(dǎo)出計量數(shù)據(jù)。蛋白印跡圖片使用Image Lab（美國，Bio-Rad）軟件進(jìn)行相對定量分析，并導(dǎo)出計量數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)結(jié)果采用Graph Pad Prism7軟件進(jìn)行方差分析和作圖。多組間的比較采用單因素方差分析。P<0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DZP 降低CAC 模型小鼠的死亡率和血清中炎癥因子的水平

與對照組相比，模型組生存率顯著降低，15 只小鼠存活9 只（P<0.01）。給藥后DZP 顯著降低了模型小鼠的死亡率，其中DZP 低劑量組存活12 只、高劑量組小鼠存活14 只（P<0.05），見圖1A。CAC 模型小鼠血清IL-1β 和IL-18 水平顯著升高（P<0.01），經(jīng)DZP 治療8 周后，顯著降低了CAC 模型小鼠血清IL-1β 和IL-18 水平（P<0.01）。見圖1B-C。

圖1 DZP 對CAC 模型小鼠的死亡率和血清炎癥因子水平的影響（）

3.2 DZP 改善CAC 模型小鼠的腸道炎癥和病理組織學(xué)

小鼠結(jié)腸組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸中IL-1β 和IL-18 水平顯著增加（P<0.01），經(jīng)DZP 治療8 周后，顯著降低了CAC 模型小鼠結(jié)腸組織中IL-1β 和IL-18 的表達(dá)水平（P<0.01），見圖2A-D。HE 染色結(jié)果顯示，CAC 模型小鼠結(jié)腸炎細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，DZP 治療后可顯著減輕CAC 模型小鼠結(jié)腸內(nèi)的炎癥。對結(jié)腸HE染色進(jìn)行組織學(xué)評分結(jié)果顯示，DZP 可改善CAC 模型小鼠結(jié)腸的病理組織學(xué)（P＜0.01）。見圖2E-F。

3.3 DZP 改善CAC 模型小鼠結(jié)腸緊密連接

免疫組織熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，CAC 模型小鼠結(jié)腸中緊密連接相關(guān)蛋白Occludin及ZO-1 的表達(dá)顯著降低（P<0.01），經(jīng)DZP 治療8周后，顯著增加了CAC 模型小鼠結(jié)腸中Occludin及ZO-1 蛋白的表達(dá)（P<0.05，P<0.01）。見圖3A-D。

3.4 DZP 促進(jìn)CAC 模型小鼠結(jié)腸自噬

小鼠結(jié)腸組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對照組相比，CAC 模型小鼠結(jié)腸中ATG5 水平顯著降低（P<0.01），經(jīng)DZP 治療8 周后，顯著增加了CAC 模型小鼠結(jié)腸組織中ATG5 的表達(dá)水平（P<0.01），見圖4A-B。蛋白印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸中SQSTM1 蛋白表達(dá)水平顯著增加（P<0.01），LC3BⅠ/Ⅱ及ATG5 的蛋白表達(dá)水平顯著降低。經(jīng)DZP 治療8 周后，顯著降低CAC 模型小鼠結(jié)腸組織中SQSTM1 的蛋白表達(dá)水平（P<0.01），并顯著上調(diào)CAC 模型小鼠結(jié)腸組織中LC3BⅠ/Ⅱ及ATG5 的蛋白表達(dá)水平。見圖4C-F。

圖2 DZP 對CAC 模型小鼠結(jié)腸炎癥及病理組織學(xué)的影響（，n=8）

4 討論

藥理實驗表明，結(jié)合AOM 及DSS 可誘導(dǎo)CAC的兩步式腫瘤模型，是研究CAC 發(fā)病機理的經(jīng)典模型。腫瘤的進(jìn)展不僅取決于其內(nèi)在因素，而且受到多方面的全身過程的影響，尤其是全身性的炎癥。在某些類型的腫瘤中，發(fā)生惡性變化之前就存在炎癥，致癌性變化又會誘發(fā)炎癥微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。炎癥促進(jìn)腫瘤的作用已被證實，包括促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，促進(jìn)血管生成和轉(zhuǎn)移[7]。本實驗結(jié)果表明，DZP 可顯著降低CAC 模型小鼠的死亡率及血清中IL-1β 和IL-18 的水平。

腸道慢性炎癥導(dǎo)致其上皮細(xì)胞因子和趨化因子誘導(dǎo)的增加，被認(rèn)為是導(dǎo)致CAC 及CRC 重要因素[8]，隨之而來的變化是腸道上皮細(xì)胞增殖、存活和遷移的改變[9]。有研究表明，發(fā)炎的結(jié)腸黏膜在沒有發(fā)生任何組織學(xué)改變之前，其分子信號經(jīng)歷了與癌癥相似的變化[10]。此外，臨床研究顯示，大腸腺瘤的患病率與患者血液中較高的IL-6 和TNF-α 濃度有關(guān)，系統(tǒng)性炎癥可能與大腸腫瘤的早期發(fā)展有關(guān)[11]。因此，抑制腸道炎癥可能是延緩或治療CAC 及CRC 的有效策略。本實驗表明，DZP 可有效抑制CAC 模型小鼠的腸道炎癥，這可能是其減輕CAC模型小鼠全身炎癥并降低小鼠死亡率的原因之一。

研究表明，腸道炎癥的增加導(dǎo)致腸道屏障的破壞，也是導(dǎo)致全身性炎癥的直接原因。正如實驗觀察到的、CAC 模型小鼠結(jié)腸中的緊密連接相關(guān)蛋白Occludin 及ZO-1 的表達(dá)顯著降低，這可能促進(jìn)了小鼠腸道炎癥和CAC 的發(fā)生。在CRC 中，自噬被認(rèn)為具有促進(jìn)腫瘤和抑制腫瘤的雙重作用[12]，但潛在機制仍不清楚。慢性炎癥會干擾自噬機制的正常運作，在上皮細(xì)胞中，自噬缺陷可以通過增強氧化應(yīng)激和基因組不穩(wěn)定性，以及激活轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[13]。一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，CRC 患者腸道組織中ATG5 下調(diào)[14]，此結(jié)果與本實驗結(jié)果一致。同時，SQSTM1 在CAC 模型小鼠結(jié)腸中的表達(dá)增加，而LC3B 的表達(dá)減少。經(jīng)DZP 治療8 周后，模型小鼠結(jié)腸LC3BⅠ/Ⅱ及ATG5 的表達(dá)增加，而SQSTM1 的表達(dá)降低。上述實驗結(jié)果表明，DZP 增強了CAC 模型小鼠結(jié)腸的自噬水平，DZP 治療CAC 作用與其促進(jìn)結(jié)腸自噬有關(guān)。

圖3 DZP 對CAC 模型小鼠結(jié)腸組織Occludin 及ZO-1 表達(dá)的影響（，n=8）

圖4 DZP 對CAC 模型小鼠結(jié)腸自噬的影響（）

綜上所述，本研究結(jié)果表明，DZP 顯著降低了CAC 模型小鼠的炎癥和死亡率，這與DZP 增加小鼠結(jié)腸自噬水平、促進(jìn)結(jié)腸緊密連接蛋白表達(dá)密切相關(guān)，但無法明確其具體作用機制，有待進(jìn)一步研究。