連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，連云港 222006

氫溴酸右美沙芬糖漿為中樞性鎮(zhèn)咳藥，可抑制延腦咳嗽中樞而產(chǎn)生鎮(zhèn)咳作用，長期服用無成癮性和耐受性。該藥現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-341）-2003Z，收載于《國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》（第45 冊(cè)）[1]，該標(biāo)準(zhǔn)中只有主成分氫溴酸右美沙芬的含量測(cè)定，并未對(duì)雜質(zhì)和防腐劑進(jìn)行質(zhì)量控制?！吨袊幍洹?015 年版四部規(guī)定糖漿劑中含蔗糖量應(yīng)不低于45%[2]，因此本品中含有高濃度的蔗糖，極易產(chǎn)生糖的降解雜質(zhì)5-羥甲基糠醛（5-HMF）。5-HMF 屬于2 類遺傳毒性雜質(zhì)，具有致突變性、致敏性和遺傳毒性等多種毒副作用[3-7]。目前遺傳毒性雜質(zhì)已成為藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)、制藥企業(yè)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)關(guān)注的焦點(diǎn)[8]。氫溴酸右美沙芬糖漿處方中還含有防腐劑苯甲酸或羥苯乙酯，防腐劑雖能夠抑制微生物在糖漿劑中生長和繁殖，但過量攝入對(duì)人體也會(huì)有一定的毒性[9-11]，尤其是兒童用藥，如苯甲酸會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)、具有細(xì)胞毒性和致癌等。羥苯酯類影響男性生殖系統(tǒng)和誘發(fā)女性乳腺癌等[9-11]，故有必要對(duì)氫溴酸右美沙芬糖漿中的降解雜質(zhì)和防腐劑的含量進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定氫溴酸右美沙芬糖漿中的氫溴酸右美沙芬、5-羥甲基糠醛、苯甲酸和羥苯乙酯的含量，有利于提高本制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（含二極管陣列檢測(cè)器，美國沃特世公司）；Waters Empower 色譜工作站；Sartorius BP211D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；KH-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

氫溴酸右美沙芬、5-羥甲基糠醛、苯甲酸、羥苯乙酯對(duì)照品（純度分別為94.8%、99.2%、99.9%、99.9%，批號(hào)分別為100201-201204、111626-201912、100419-201703、100847-201604）均購自中國食品藥品檢定研究院；氫溴酸右美沙芬糖漿（廠家A，批號(hào)為190202、190602、190802、200103，規(guī)格0.15%；廠家B，批號(hào)為190205、190301、190411、190502，規(guī)格0.2%）；甲醇為色譜純；磷酸二氫銨、磷酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（取磷酸二氫銨11.5 g，加磷酸1 mL，用水稀釋至1000 mL）（B）；梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～11 min，15%A→50%A；11～26 min，50%A；26～27 min，50%A→15%A；27～35 min，15%A）；檢測(cè)波長：279 nm；柱溫：30 ℃；體積流量：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取氫溴酸右美沙芬、5-羥甲基糠醛、苯甲酸、羥苯乙酯對(duì)照品適量，用甲醇-水（1∶1）溶解配制成1.4604、0.09715、1.3540、0.2924 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取該儲(chǔ)備液2 mL，置10 mL 量瓶中，甲醇-水（1∶1）定容至刻度，搖勻，制成每毫升分別含上述成分0.2921、0.01943、0.2708、0.05848 mg 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取供試品5 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇-水（1∶1）適量，超聲處理10 min，使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 以溶劑甲醇-水（1∶1）作為陰性樣品溶液。

2.3 專屬性考察

取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

檢測(cè)表明，5-羥甲基糠醛、苯甲酸、氫溴酸右美沙芬、羥苯乙酯均能達(dá)到基線分離，待測(cè)成分色譜峰的理論塔板數(shù)均大于3000，各成分之間無干擾，證明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.5、1、2、4、6 mL，分別用甲醇-水（1∶1）定容于10 mL 量瓶中，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)的色譜條件對(duì)上述系列混合對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，并繪制出橫、縱坐標(biāo)分別為質(zhì)量濃度（μg·mL-1）和峰面積（Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得氫溴酸右美沙芬、5-羥甲基糠醛、苯甲酸和羥苯乙酯的回歸方程及線性范圍（n=6），分別為Y=6.6002×103X－2.2593×104（r=0.9998，29.21～876.2 μg·mL-1）；Y=1.3768×105X－3.2880×104（r=0.9997，1.94～58.29 μg·mL-1）；Y=7.3378 ×103X－1.8058×104（r=0.9998，27.08～812.4 μg·mL-1）；Y=3.2497×104X－2.3063×104（r=0.9997，5.85～175.4 μg·mL-1）。

2.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果氫溴酸右美沙芬、5-羥甲基糠醛、苯甲酸和羥苯乙酯峰面積的RSD 分別為0.32%、0.46%、0.26%、0.37%，表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取已知含量的供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果氫溴酸右美沙芬、5-羥甲基糠醛、苯甲酸和羥苯乙酯峰面積的RSD 分別為0.84%、1.03%、0.76%、1.48%，表明穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，結(jié)果廠家A（批號(hào)190802）中氫溴酸右美沙芬、5-羥甲基糠醛、苯甲酸的平均含量分別為1.41、0.10、1.34 mg·mL-1，RSD 為0.53%、0.86%、0.46%；廠家B（批號(hào)190502）氫溴酸右美沙芬、5-羥甲基糠醛、羥苯乙酯的平均含量分別為1.90、0.05、0.29 mg·mL-1，RSD 為0.77%、1.32%、1.09%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的供試品（批號(hào)190802）6份，每份1 mL，置10 mL 量瓶中，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定其峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取氫溴酸右美沙芬糖漿各批樣品適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg·mL-1，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本研究考察甲醇-水、甲醇-磷酸二氫銨緩沖液系統(tǒng)作為流動(dòng)相，分別進(jìn)行等度、梯度洗脫，在等度洗脫條件下幾種組分分離不理想且耗時(shí)較長；采用梯度洗脫時(shí)發(fā)現(xiàn)，5-HMF 極性大，在有機(jī)相比例較小時(shí)就很快出峰，而苯甲酸、氫溴酸右美沙芬、羥苯乙酯在有機(jī)相比例較高時(shí)才能較快出峰，為了縮短分析時(shí)間，在梯度程序的后半段調(diào)高了有機(jī)相比例。結(jié)果采用甲醇-磷酸二氫銨緩沖液系統(tǒng)并進(jìn)行梯度洗脫，樣品中各待測(cè)組分之間能夠有效分離，且相鄰成分不干擾測(cè)定。

3.2 溶劑與提取方法的選擇

在試驗(yàn)中對(duì)比了不同的提取溶劑水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇對(duì)各成分的提取效果，結(jié)果以50%甲醇作為提取溶劑時(shí)，樣品中所測(cè)成分綜合提取效果最佳；同時(shí)考察超聲時(shí)間0、5、10、20 min 對(duì)提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲10 min 即可提取完全。

3.3 測(cè)定波長的選擇

試驗(yàn)采用DAD 檢測(cè)器，在190～400 nm 的范圍內(nèi)對(duì)待測(cè)成分色譜峰進(jìn)行全波長掃描，氫溴酸右美沙芬、5-羥甲基糠醛、苯甲酸和羥苯乙酯分別在279 nm、284 nm、273 nm、257 nm 處有最大吸收。根據(jù)四種成分的紫外光譜圖進(jìn)行分析，綜合考慮，選擇279 nm 波長較合適，在此波長條件下，四種組分均有較強(qiáng)響應(yīng)值。

3.4 結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)收集了市售的2 個(gè)廠家共8 批氫溴酸右美沙芬糖漿，結(jié)果顯示，同一廠家的防腐劑用量無明顯差異?！吨袊幍洹?015 年版四部通則中糖漿劑項(xiàng)下規(guī)定：苯甲酸用量不得過0.3%，羥苯酯類用量不得過0.05%[2]。試驗(yàn)測(cè)得的8 批樣品中的防腐劑用量均在藥典規(guī)定范圍內(nèi)。5-HMF 在8 批樣品中均有檢出，不同廠家不同批號(hào)之間5-HMF 含量有明顯差異。廠家A 氫溴酸右美沙芬糖漿用量為一次20mL，一日3 次，則5-HMF 最大日暴露量為15.78 mg；廠家B 氫溴酸右美沙芬糖漿用量為一次15 mL，一日3 次，則5-HMF 最大日暴露量為2.25 mg，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出了5-HMF 作為2 類遺傳毒性雜質(zhì)限度（TTC 為1.5 μg·d-1）的要求[3]。由于TTC 是高度保守的暴露量，限度制定也需根據(jù)生產(chǎn)工藝難度及用藥周期等情況進(jìn)行調(diào)整。文獻(xiàn)[3]中報(bào)道，2015 年版藥典中收載的5%、10%葡萄糖注射液及以葡萄糖注射液為載體的制劑的最大日暴露量分別為1.75 mg、3.5 mg 和5 mg，根據(jù)樣品中5-HMF 檢出情況，參考最大日暴露量5 mg 來制定本品的限度，經(jīng)折算，廠家A（規(guī)格0.15%，每日最大用量60 mL）的限度為0.08 mg·mL-1，廠家B（規(guī)格0.2%，每日最大用量45 mL）的限度為0.11 mg·mL-1，結(jié)果，廠家B 4 批樣品5-HMF 均在限度范圍內(nèi)，廠家A 有3 批樣品超出限度，建議完善生產(chǎn)工藝，或兼顧安全性和質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)兩方面的因素，綜合考慮制定合適的限值。防腐劑和遺傳毒性雜質(zhì)對(duì)人體的毒副作用越來越受到重視，有些廠家已經(jīng)對(duì)口服液體制劑中的防腐劑或5-HMF 進(jìn)行質(zhì)量控制并訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，本研究建立的方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，既提高了氫溴酸右美沙芬糖漿的質(zhì)量控制，又簡化了檢驗(yàn)過程，為修訂該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。