管麗紅，賈紫森，林俊堂，3

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南省干細(xì)胞醫(yī)學(xué)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南省干細(xì)胞與生物治療技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省醫(yī)用組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）及CRISPR 相關(guān)核酸內(nèi)切酶（CRISPR associated protein，Cas）系統(tǒng)是古生菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一類獲得性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠從初次入侵的外源DNA中獲得一小段序列；當(dāng)同樣的外源DNA再次入侵時，該系統(tǒng)即可轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA，從而識別并引導(dǎo)Cas蛋白切割外源DNA，導(dǎo)致外源DNA最終被降解［1］?？茖W(xué)家們基于CRISPR-Cas系統(tǒng)識別和切割DNA的功能，將CRISPR-Cas9系統(tǒng)發(fā)展為一種由RNA指導(dǎo)核酸內(nèi)切酶的基因編輯技術(shù)［2］。CRISPRCas9技術(shù)通過一段長度為20 nt的單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）序列引導(dǎo)Cas9蛋白對目標(biāo)DNA進(jìn)行切割，造成雙鏈DNA的斷裂，從而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的同源重組修復(fù)或非同源末端連接修復(fù)，利用細(xì)胞的自身修復(fù)機(jī)制對DNA進(jìn)行修復(fù)，最終導(dǎo)致目標(biāo)DNA的缺失或插入突變［3-4］。這一技術(shù)以其簡單、高效、成本低等優(yōu)勢獲得科學(xué)家的青睞，迅速被用于不同物種的基因組編輯。本文主要闡述CRISPR-Cas9技術(shù)在基因組編輯和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的應(yīng)用。

1 CRISPR-Cas9技術(shù)在基因組編輯中的應(yīng)用

2012年，JINEK等［5］研究發(fā)現(xiàn)，將CRISPR RNA（crRNA）與反式激活crRNA融合為一個嵌合體RNA后，能夠指導(dǎo)Cas9切割雙鏈DNA。隨后，sgRNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas9技術(shù)被廣泛用于細(xì)菌、昆蟲、植物和動物的基因功能研究［6-9］。下面就CRISPR-Cas9技術(shù)在動物細(xì)胞和體內(nèi)基因敲除及基因治療中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1.1 CRISPR-Cas9技術(shù)在基因敲除中的應(yīng)用CRISPR-Cas9最常用于構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系和動物模型。2013年，HWANG等［10］利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功敲除斑馬魚的細(xì)胞毒性顆粒相關(guān)RNA結(jié)合蛋白1和糖原合成酶激酶-3β基因，證明該技術(shù)與鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)一樣可以有效編輯斑馬魚的基因組。同年，NAKAYAMA等［11］利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功敲除熱帶爪蟾的酪氨酸酶（tyrosinase，tyr）基因，導(dǎo)致其眼睛出現(xiàn)白化病表型，這一研究為熱帶爪蟾的基因功能研究提供了有效技術(shù)。LI等［12］利用2個sgRNA引導(dǎo)Cas9成功敲除小鼠的泛素樣植物同源和環(huán)指結(jié)構(gòu)域（ubiquitin like with PHD and ring finger domains 2，Uhrf2）基因，此外，該研究將Casq mRNA和2個sgRNA共注射到大鼠一細(xì)胞期胚胎中，同時敲除腎上腺皮質(zhì)3受體（melanocortin 3 rceptor，Mc3R）和腎上腺皮質(zhì)4受體（melanocortin 4 receptor，Mc4R）基因，證明CRISPR-Cas9技術(shù)可用于多基因功能缺失的研究。2014年，NIU等［13］利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功編輯了食蟹獼猴的過氧化物酶體增殖體激活受體γ基因和重組激活基因1，證明該技術(shù)能夠在靈長類動物中得到應(yīng)用。2015年，LIANG等［14］利用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯了人的三原核受精卵的β球蛋白基因，這是將CRISPR-Cas9技術(shù)首次應(yīng)用到人類胚胎的研究，但這一研究引起了國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于倫理的爭論。2016年，SHINMYO 等［15］利用CIRSPR-Cas9技術(shù)聯(lián)合子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功敲除胚胎期小鼠腦內(nèi)特異的富含AT序列結(jié)合蛋白2（special AT-rich sequence binding protein 2，Satb2）基因，導(dǎo)致小鼠大腦皮層中Satb2表達(dá)量明顯下降，證明CIRSPR-Cas9技術(shù)可以用于編輯神經(jīng)細(xì)胞。2017年，GANDHI等［16］利用CIRSPR-Cas9技術(shù)聯(lián)合電轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功敲除了在神經(jīng)嵴發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子配對盒7和性別決定區(qū)域Y-框10基因，使其在早期雞胚發(fā)育中失去了功能，說明CIRSPR-Cas9技術(shù)在雞胚靶向基因敲除中有較好的應(yīng)用價值。2018年，ROH 等［17］分別將靶向瘦素（leptin，Lep）和瘦素受體（leptin receptor，Lepr）基因的sgRNA和Cas9 mRNA共注射入小鼠受精卵中，獲得了Lep和Lepr基因敲除的小鼠模型，其表現(xiàn)出與肥胖（ob/ob）和糖尿病（db/db）小鼠相似的體質(zhì)量增加、高血糖和脂肪肝等，證實(shí)CIRSPR-Cas9技術(shù)可用于肥胖和糖尿病的研究。2019年，RASYS等［18］利用CIRSPR-Cas9技術(shù)聯(lián)合顯微注射技術(shù)將Cas9蛋白和3個靶向tyr基因的sgRNA同時轉(zhuǎn)入安樂蜥的未成熟卵母細(xì)胞中，最終獲得了白化病表型的安樂蜥模型，這一研究填補(bǔ)了CIRSPR-Cas9技術(shù)在爬行類動物研究中應(yīng)用的空白。2020年，BYAMBAA等［19］將靶向白細(xì)胞介素-2受體γ鏈基因的sgRNA和Cas9 mRNA共注射到小鼠受精卵中，成功獲得了X連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥（X-linked severe combined immunodeficiency，X-SCID）模型，為X-SCID基因編輯治療的評估提供了有價值的動物模型。

1.2 CRISPR-Cas9技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用CRISPR-Cas9最具前景的應(yīng)用是對于疾病的基因治療。2013年，WU等［20］利用CRISPR-Cas9技術(shù)修復(fù)了白內(nèi)障小鼠受精卵的晶狀體γC基因突變，并且可以穩(wěn)定地遺傳給后代。2014年，YIN等［21］靶向I型酪氨酸血癥小鼠的Fah基因突變，通過尾靜脈注射的方式將連接有特異sgRNA和Cas9的pX330載體和單鏈寡核苷酸（single-stranded DNA，ssDNA）注射入小鼠體內(nèi)，獲得了正常表型的小鼠。2015年，SCHUMANN等［22］利用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯人類原代T細(xì)胞的趨化因子受體（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）基因，導(dǎo)致CXCR4蛋白的表達(dá)降低。CXCR4是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的入侵受體，其表達(dá)量降低可抑制HIV的入侵，因此，這一研究為HIV感染的治療提供了新的方法。2016年，YANG等［23］通過靜脈注射2個腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體（1個AAV 載體攜帶sgRNA 和供體DNA，另1個AAV載體攜帶Cas9）修復(fù)了高血氨癥新生小鼠約10%的肝細(xì)胞中鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因突變，并延長了小鼠的壽命。同年，GUAN等［24］構(gòu)建了凝血因子9（coagulation factor IX，F(xiàn)9）基因Y371D突變的血友病B小鼠模型，分別利用裸DNA載體和腺病毒（adenovirus，AdV）載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas9技術(shù)修復(fù)其基因突變，其中，接受裸DNA載體的小鼠，肝細(xì)胞中F9基因的校正率超過0.56%，能夠恢復(fù)止血作用；而AdV傳遞系統(tǒng)雖然能夠糾正基因突變，但由于可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝毒性而達(dá)不到治療效果。2017年，KOLLI等［25］利用CRISPR-Cas9技術(shù)在亨廷頓舞蹈癥（Huntington′s disease，HD）YAC128小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成功沉默了突變的亨廷頓（huntingtin，HTT）基因；YANG等［26］利用CRISPR-Cas9技術(shù)在HD140Q敲入小鼠模型中永久地抑制了突變HTT基因的功能，從而改善了HD 小鼠的神經(jīng)毒性。2018年，GY?RGY等［27］利用AAV將靶向?qū)е掳柎暮Ｄ。ˋlzheimer′s disease，AD）的瑞典突變（APPswe）基因的sgRNA和Cas9分別轉(zhuǎn)入從APPSW轉(zhuǎn)基因小鼠（Tg2576）胚胎分離的原代神經(jīng)元和成年小鼠海馬區(qū)，結(jié)果顯示，其能降低致病的β-淀粉樣蛋白的表達(dá)。2019年，EKMAN等［28］應(yīng)用AAV將靶向HTT突變基因的sgRNA和Cas9轉(zhuǎn)入HD R6/2小鼠紋狀體區(qū)域，使HTT突變蛋白在神經(jīng)元中的表達(dá)降低了約50%，并且延長了小鼠的壽命，改善了小鼠的運(yùn)動障礙。2020年，PINZON-ARTEAGA等［29］設(shè)計了靶向?qū)е绿窃种溉狈Φ奶窃种?（glycogen branching enzyme 1，GBE1）基因C＞A突變位點(diǎn)的sgRNA，并連接到pX458載體上，將其與ssDNA共轉(zhuǎn)染至原代馬成纖維細(xì)胞中進(jìn)行了基因修復(fù)，修復(fù)效率達(dá)20%。這些突破性研究為一些難治性疾病的治療帶來了新的希望。

2 CRISPR-Cas9技術(shù)在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的應(yīng)用

CRISPR-Cas9不僅可以從基因組水平編輯基因，也可以對特定的轉(zhuǎn)錄序列進(jìn)行抑制或激活。2013年，QI等［30］將D10A和H840A 2個突變位點(diǎn)分別引入化膿性鏈球菌Cas9（SpCas9）的RuvC和HNH 2個切割域，導(dǎo)致Cas9蛋白不能行使切割DNA的功能，但仍保留與DNA結(jié)合的能力，這種失去核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白被稱為死亡Cas9（dead Cas9，dCas9）。因此，科學(xué)家們利用dCas9結(jié)合DNA序列的能力，發(fā)展出能夠抑制基因表達(dá)的CRISPR干擾（CRISPR interference，CRISPRi）技術(shù)和激活基因表達(dá)的CRISPR激活（CRISPR activation，CRISPRa）技術(shù)［31］。

2.1 CRISPRi的轉(zhuǎn)錄抑制作用當(dāng)dCas9與靶基因的閱讀框結(jié)合時，能夠阻斷RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）的延伸；當(dāng)dCas9結(jié)合到靶基因的啟動子或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcriptional start sites，TSSs），可阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始。2013年，BIKARD等［32］靶向綠色熒光蛋白（green fluorescent proteins，GFP）報告質(zhì)粒的開放閱讀框和啟動子，設(shè)計了22個不同的crRNAs，該研究結(jié)果顯示，不同的crRNA均能誘導(dǎo)dCas9抑制GFP的表達(dá)，導(dǎo)致該質(zhì)粒在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達(dá)GFP的強(qiáng)度下降。2014年，ZHAO等［33］利用CRISPRi技術(shù)成功抑制了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 NIH3T3 中微 RNA（micro RNA，miR）-21和miR-30a的表達(dá)，證明該技術(shù)可用于miRNAs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。2015年，SUN等［34］利用CRISPRi技術(shù)在造血特異性miR-142缺陷T細(xì)胞中沉默非典型E2F轉(zhuǎn)錄因子E2f7和E2f8，改善了細(xì)胞周期缺陷并降低了移植物抗宿主?。╣raftversus-host disease，GVHD）發(fā)生率，這一研究為GVHD提供了潛在的治療策略。2016年，HEMAN-ACKAH等［35］將dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制子KRAB融合，利用sgRNA靶向帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）致病基因α-突觸核蛋白（synuclein，SNCA）基因的TSSs，使由SNCA三倍化引起的PD患者中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）分化的神經(jīng)元中SNCA表達(dá)量明顯降低。2017年，LIU等［36］應(yīng)用CRISPRi技術(shù)在不同細(xì)胞系中成功抑制了長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）的表達(dá)，證實(shí)該技術(shù)可用于lncRNAs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。2018年，YOSHIDA等［37］采用整合的CRISPRi技術(shù)抑制了ΔNp63的轉(zhuǎn)錄，有效降低了肺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和克隆，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；還可顯著抑制肺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌小鼠腫瘤的生長。2019年，WANG 等［38］將dCas9分別與轉(zhuǎn)錄抑制因子KRAB、Hairy、SID、SRDX和ERD結(jié)合，與相應(yīng)的sgRNAs共轉(zhuǎn)染至家蠶細(xì)胞中，均能不同程度抑制其靶基因的表達(dá)；共轉(zhuǎn)染dCas9-SID、dCas9-SRDX和dCas9-ERD及相應(yīng)的sgRNAs后，可在家蠶細(xì)胞中同時抑制其靶基因的表達(dá)，這一研究表明，CRISPRi技術(shù)可應(yīng)用于家蠶和其他鱗翅目昆蟲基因組功能研究中。2020年，HAZELBAKER等［39］建立了AAVS1介導(dǎo)的多西環(huán)素誘導(dǎo)的piggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子與dCas9-KRAB系統(tǒng)，能夠有效抑制人類多能干細(xì)胞中皮特-霍普金斯綜合征和精神分裂癥相關(guān)基因TCF4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，該研究有助于進(jìn)行單個基因和通路的功能剖析及大規(guī)模對生長發(fā)育和疾病相關(guān)基因的篩查。

2.2 CRISPRa的轉(zhuǎn)錄激活作用當(dāng)dCas9與具有轉(zhuǎn)錄激活功能蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域或TSSs結(jié)合時，可以激活基因的轉(zhuǎn)錄。2013年，MAEDER等［40］研究發(fā)現(xiàn)，將dCas9與轉(zhuǎn)錄激活子VP64融合后，在特異sgRNA的引導(dǎo)下，能夠顯著促進(jìn)人胚腎細(xì)胞HEK293中血管內(nèi)皮生長因子A基因和神經(jīng)營養(yǎng)因子3基因的轉(zhuǎn)錄。BIKARD等［32］將dCas9與RNAP的ω亞基融合，能夠提高RNAP的活性，使得GFP的表達(dá)顯著上調(diào)。2014年，GAO等［41］將PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)與CRISPRa技術(shù)結(jié)合，應(yīng)用sgRNA靶向增強(qiáng)子，激活了有機(jī)陽離子/肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（organic cation/carnitine transporter 4，Oct4）和Nanog同源框（Nanog homeobox，Nanog）基因在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 中的轉(zhuǎn)錄。2015年，NIHONGAKI等［42］和POLSTEIN等［43］分別建立了包含2個融合蛋白和sgRNAs的基于CRISRP-Cas9的光激活轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，第1個融合蛋白包括dCas9和隱花色素相互作用的基本螺旋環(huán)1（cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 1，CIB1），由sgRNAs引導(dǎo)其靶向特異的基因組位點(diǎn)；第2個融合蛋白包括光敏感的隱花色素2（cryptochrome 2，CRY2）或其光裂合酶同源區(qū)（cryptochrome 2 photolyase homology region，CRY2PHR）和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。無藍(lán)光照射時，sgRNAs引導(dǎo)第1個融合蛋白結(jié)合到靶基因的啟動子上，而第2個融合蛋白分散在細(xì)胞核中；藍(lán)光照射時，CRY2或CRY2PHR與CIB1形成異二聚體，隨后轉(zhuǎn)錄激活區(qū)被招募到靶基因處，進(jìn)而激活基因表達(dá)。這種光誘導(dǎo)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可有效地在HEK293T細(xì)胞中動態(tài)調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的激活，可用于需要精確空間和（或）時間控制細(xì)胞行為的基礎(chǔ)科學(xué)、合成生物學(xué)和組織工程研究中。同年，ZIETSCHE等［44］開發(fā)了一種“分裂的Cas9結(jié)構(gòu)”（將Cas9分為C端和N端2個部分），通過雷帕霉素誘導(dǎo)可以重建功能完整的Cas9核酸酶，在HEK293FT和N2A細(xì)胞中激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。2016年，HEMAN-ACKAH等［35］將dCas9與三重轉(zhuǎn)錄激活子VP64-p65-Rta融合，應(yīng)用sgRNA靶向PD致病基因SNCA的TSSs，使健康人iPSC分化的神經(jīng)元中SNCA的表達(dá)水平增加，與由三倍化引起的PD患者iPSC分化的神經(jīng)元中SNCA的表達(dá)量相近。2017年，LI等［45］將PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)與CRISPRa技術(shù)結(jié)合，用于激活多個內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子和lncRNAs的轉(zhuǎn)錄，并證明該系統(tǒng)能夠加速iPSCs向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，這一研究結(jié)果預(yù)示著PB-CRISPRa系統(tǒng)在神經(jīng)科學(xué)研究中具有潛在的應(yīng)用價值。2018年，PUTRI等［46］首次將CRISPRa和光遺傳學(xué)系統(tǒng)聯(lián)合用于斑馬魚中，在斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞中成功激活了achaete-scute家族 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1a（achaete-scute family bHLH transcription factor 1a，ASCL1a）、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤6a（B-cell CLL/lymphoma 6a，BCL6a）和熱休克蛋白70基因的表達(dá)。2019年，MATHARU等［47］將dCas9與VP64融合后，利用CRISPRa技術(shù)分別靶向?qū)κ秤{(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用的專一家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1（single-minded family bHLH transcription factor 1，Sim1）和Mc4R基因啟動子或下丘腦特異增強(qiáng)子，從而提高了Sim1或Mc4R基因的表達(dá)，減輕了Siml或Mc4R單倍劑量不足小鼠的肥胖程度，這些研究為CRISPRa系統(tǒng)用于治療因基因劑量敏感導(dǎo)致的疾病提供了理論依據(jù)。2020年，COLASANTE等［48］利用多西環(huán)素誘導(dǎo)的CRISPRa技術(shù)增加了鉀離子通道基因在顳葉癲癇模型小鼠海馬興奮性神經(jīng)元中的表達(dá)，減輕了自發(fā)性全身強(qiáng)直陣攣性癲癇發(fā)作，并成功改善了與慢性癲癇相關(guān)的認(rèn)知障礙，這一研究為基于CRISPRa的神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 結(jié)語與展望

盡管CRISPR-Cas9技術(shù)在基因組編輯中應(yīng)用廣泛，但其也存在著不可避免的缺陷，如脫靶效應(yīng)［49-50］。自CRISPR-Cas9技術(shù)問世以來，科學(xué)家們一直致力于提高其特異性，例如，NAITO等［51］設(shè)計了CRISPRdirect軟件，根據(jù)不同條件限制篩選特定序列的sgRNA以降低脫靶效應(yīng)；SLAYMAKER等［52］通過突變Cas9的幾個氨基酸位點(diǎn)來提高其靶向性，降低其脫靶效應(yīng)；SHEN等［53］受合成生物學(xué)的啟發(fā)，建立了一個合成開關(guān)，不僅在轉(zhuǎn)錄階段通過sgRNA對Cas9基因進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，而且在翻譯階段通過L7Ae：K-turn抑制系統(tǒng)進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，限制性的Cas9表達(dá)可誘導(dǎo)高效的靶向插入或缺失突變，同時最小化脫靶效應(yīng)。CRISPR-Cas9技術(shù)在基礎(chǔ)研究中發(fā)揮著巨大作用，探索如何將其安全高效地運(yùn)用于臨床研究和基因治療中必將對臨床醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

志謝：感謝韓亞偉博士、楊慈清博士、喬梁博士和李小英老師對本文的建議與修改！