張旭紅，馮雪喆，郭欣欣，趙德鑫，李宇，楊文靜，陳杰

(1. 烏蘭察布市中心醫(yī)院產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學人體解剖學教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

伴隨腫瘤診療技術(shù)的飛速發(fā)展，病灶早期發(fā)現(xiàn)并施以精準治療，使得腫瘤患者長期存活成為可能[1]，為此，抗癌治療后患者的生活質(zhì)量成為關注焦點。青年及未成年女性癌癥患病率逐年上升[2]，如何避免醫(yī)源性因素造成的卵巢早衰？如何在抗癌治療過程中保護患者生育能力？是對生殖醫(yī)學領域提出的嚴峻挑戰(zhàn)。

卵巢組織玻璃化凍存技術(shù)是在患者接受抗癌治療前凍存卵巢組織，待抗癌治療結(jié)束后解凍卵巢組織并回植入患者體內(nèi)，不僅沒有耽誤抗癌治療，還可有效保存生育力，提高患者生存質(zhì)量[3]。目前存在的問題是如何提高凍存效率，減少凍存過程中卵泡丟失、冰晶形成以及卵巢組織早衰等不利因素[4]。FSH 是重要的卵泡存活因子，可有效縮短凍融卵巢組織血流再灌注時間，提高凍存效率，在維護卵泡正常形態(tài)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮積極作用[5]。bFGF 具有促進增殖平滑肌細胞以及內(nèi)皮細胞游走的作用，是血管生成過程中重要的刺激因子，可促進新生血管形成，對受損的內(nèi)皮細胞具有修復作用[6,7]。為此，我們擬通過觀察小鼠卵巢玻璃化凍存過程中FSH 干預性保護措施對卵泡bFGF 蛋白表達的影響，證實FSH 干預的有效性，為臨床體外凍存技術(shù)提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物4 周齡C57BL/6J(證號:000664)雌性小鼠，光照周期為12h 照明/12h 黑暗，室溫保持在22℃-24℃，自由取食飲水。

1.1.2 主要試劑促卵泡刺激素(FSH)

注射用重組人促卵泡刺激素(果納芬)(生產(chǎn)廠家：瑞士默克雪蘭諾制藥廠，批準文號：S20080030)，人血清白蛋白(純度≥96%)(Sigma)，一抗bFGF(Abcam)為兔抗小鼠多克隆抗體。

1.2 實驗方法

1.2.1 液體的配置基液

DMEM 與F12 等比例配置。培養(yǎng)液：含12%人血清白蛋白(HSA)。預平衡液：含1.5mol/L 乙二醇。玻璃化液：EG5.5-30 玻璃化液。解凍液：分別為含0.5mol/L、0.25mol/L 以及0.125mol/L 的蔗糖液。

1.2.2 卵巢的獲取采用動情間期小鼠，取完整卵巢組織并剝除被膜。

1.2.3 實驗分組根據(jù)研究目的，將卵巢組織隨機分組，每組6 枚，共分為3 組：①新鮮對照組(CG)：新鮮提取卵巢組織后，不施加任何干預直接固定、提蛋白。②玻璃化凍存對照組(VCG)：整個凍存過程無FSH 干預。③0.3IU/mL FSH 全程干預玻璃化凍存組(OG-FSH)：凍存全程添加FSH。

1.2.4 正常卵泡百分比計算[8]連續(xù)切片后進行HE 染色，每隔5 張選取一張切片，每組取6 張切片，在高倍鏡下每張切片選取5 個高倍視野，根據(jù)卵泡形態(tài)的正常與否進行每高倍視野(high power field,HPF)的卵泡計數(shù)。

1.2.5 bFGF 免疫組織化學觀察

①石蠟切片常規(guī)脫蠟至脫水。②抗原修復。③3% H2O2室溫孵育。④山羊血清工作液封閉。⑤滴加一抗(1:100)。⑥恢復室溫，PBS 沖洗。⑦滴加二抗。⑧DAB 顯色。⑨復染。⑩封片。

1.2.6 bFGF 蛋白定量分析

①提取小鼠卵巢組織蛋白，檢測蛋白含量。②備板。③上樣。④跑膠。⑤轉(zhuǎn)膜。⑥封閉。⑦5%脫脂奶粉稀釋一抗(1:100)，4℃孵育過夜。⑧5%脫脂奶粉稀釋二抗(1:10000)。⑨暗室中顯色曝光。⑩Quantity One 軟件分析實驗結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析。以(±s)表示計數(shù)資料、計量資料，采用單因素方差分析(One way ANOVA in Statistics)檢驗。計算F 值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織形態(tài)學觀察

HE 染色結(jié)果表明，VCG 組卵母細胞皺縮明顯，正常卵泡百分比各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=29.230，P=0.002)。其中VCG 組正常卵泡百分比顯著低于CG 組和OG-FSH 組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1，表1。

圖1 卵巢組織形態(tài)學觀察(×400)

表1 卵巢組織形態(tài)學觀察結(jié)果( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

表1 卵巢組織形態(tài)學觀察結(jié)果( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

注：★與其他組比較差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

正常卵泡百分比/%CG(n=6 枚) 6.249±0.020 19.006±0.003 0.404±0.081 VCG(n=6 枚) 3.987±0.059 20.153±0.012 0.175±0.072★OG-FSH(n=6 枚) 8.356±0.019 18.877±0.028 0.533±0.072分組 正常卵泡數(shù)/(個/HP)卵泡總數(shù)/(個/HP)

2.2 卵巢組織bFGF 蛋白免疫組織化學法檢測

免疫組織化學技術(shù)檢測結(jié)果顯示，bFGF 主要表達于細細胞核，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=34.449，P=0.000)。其中OG-FSH 組bFGF 蛋白表達量顯著高于CG 組和VCG 組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2，表2。

圖2 卵巢組織bFGF 蛋白表達結(jié)果(×400)

表2 卵巢組織bFGF 蛋白表達IOD 值統(tǒng)計結(jié)果 ( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

表2 卵巢組織bFGF 蛋白表達IOD 值統(tǒng)計結(jié)果 ( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

注：★與其他組比較差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

分組 IOD 值CG(n=6 枚) 0.202±0.010 VCG(n=6 枚) 0.071±0.009 OG-FSH(n=6 枚) 0.533±0.018★

2.3 卵巢組織bFGF 蛋白表達的western-blot 檢測結(jié)果

western-blot 檢測結(jié)果表現(xiàn)為，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=15.694，P=0.007)。其中VCG 組bFGF 蛋白表達量顯著低于CG 組及OG-FSH 組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖3，表3。

圖3 卵巢組織bFGF 蛋白western-blot 檢測結(jié)果

表3 卵巢組織bFGF 蛋白表達結(jié)果( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

表3 卵巢組織bFGF 蛋白表達結(jié)果( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

注：★與其他組比較差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

分組 灰度值CG(n=6 枚) 0.294±0.028 VCG(n=6 枚) 0.092±0.002★OG-FSH(n=6 枚) 0.403±0.018

3 討論

目前的實驗技術(shù)方法雖然實現(xiàn)了卵巢組織的快速冷凍，同時玻璃化液的滲透保護作用也大大提高了凍存效率，但卵巢組織玻璃化凍存技術(shù)在為女性癌癥患者帶來福音的同時仍然存在風險，卵泡的丟失和損傷在所難免[9]。卵巢儲備功能是女性生育力的反映[10,11]，F(xiàn)SH 在抑制卵泡顆粒細胞凋亡的同時成為重要的卵泡天然保護因子[12]。王燕蓉團隊前期研究成果顯示[13]，小鼠卵巢玻璃化凍融過程中添加FSH 可提高卵泡存活率且縮短無血管吻合移植后的血管重建時間。bFGF是血管內(nèi)皮細胞很強的促分裂劑和趨化因子[14]，其作為新生血管的主要調(diào)控因子[15]、特異性血管增殖因子，可通過酪氨酸酶受體(內(nèi)皮細胞中)高效作用于血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞增殖、血管形成。同時，bFGF 誘導生成的新血管通透性高，血漿蛋白易滲透至細胞外基質(zhì)，利于成纖維細胞、內(nèi)皮細胞的發(fā)生、發(fā)展[16]。

本實驗HE 染色的凍融卵泡形態(tài)學觀察顯示，F(xiàn)SH 在小鼠卵巢玻璃化凍存全程的保護性干預可有效提高正常卵泡百分比，在保護卵泡形態(tài)結(jié)方面效果顯著，抑制了冷凍過程冰晶形成對卵泡的結(jié)構(gòu)損傷，抑制了顆粒細胞的凋亡。OG-FSH組正常卵泡百分比顯著高于玻璃化凍存對照組，但是與新鮮對照組相比較，OG-FSH 組雖然正常卵泡百分比更高，但是差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明FSH 有效提高了凍融卵泡存活率，抑制了卵母細胞皺縮的發(fā)生，保護效果甚至達到卵泡未經(jīng)歷玻璃化凍存水平。

bFGF 蛋白表達實驗結(jié)果顯示，經(jīng)免疫組織化學技術(shù)分析，bFGF 陽性細胞表達量IOD 值從高到低依次為：OG-FSH組、CG 組、VCG 組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示，F(xiàn)SH 在玻璃化凍存的干預有效促進了bFGF 蛋白的表達，在保護卵泡少受凍存損傷的同時可加速血管內(nèi)皮細胞的成活與增值，為局部受損的卵巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)構(gòu)建了新的血管橋梁，從而保證多數(shù)卵泡的存活與正常生長發(fā)育。bFGF 蛋白的western-blot 免疫印記結(jié)果與形態(tài)學觀察及免疫組織化學技術(shù)檢測結(jié)果表達趨勢一致，表現(xiàn)為凍存全程添加FSH 的干預保護措施更有利于bFGF 蛋白的表達，充分證實bFGF 不僅在促進新生血管發(fā)生方面效果顯著，同時存在FSH 激素依賴性。FSH 可協(xié)同bFGF 的血管保護作用，提高血管增值率，加強內(nèi)皮細胞的通透性，促進內(nèi)皮細胞的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究顯示，F(xiàn)SH 在小鼠卵巢玻璃化凍存過程中可加速縫隙連結(jié)蛋白的表達，加強卵泡發(fā)育過程中細胞間信號轉(zhuǎn)導，促進細胞間營養(yǎng)物質(zhì)供給。而表達于細胞核的bFGF 是否通過細胞間通訊系統(tǒng)發(fā)揮對凍融卵泡的保護和促進作用？其是否受到細胞間縫隙連結(jié)蛋白的間接調(diào)控？需要我們進一步的研究和證實。

綜上所述，F(xiàn)SH 在玻璃化凍存過程中的保護性干預可有效促進堿性成纖維細胞生長因子bFGF 的高表達，提高新生血管的發(fā)生率，間接阻止凍融過程中冰晶形成等不利因素的發(fā)生，提高凍存效率，降低凍融過程的卵泡丟失量，減少卵泡凋亡的發(fā)生，為臨床操作提供可靠的實驗室依據(jù)。