劉建國 郭克婷 肖艷輝 林浴霞 朱云娜

摘要：【目的】克隆小白菜銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（BcAMT1;2），檢測其組織表達(dá)特異性并驗(yàn)證其功能，為深入探究BcAMT1;2基因在小白菜NH4+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用機(jī)制提供理論參考?！痉椒ā恳孕“撞似贩N上海青為材料，采用同源克隆方法克隆BcAMT1;2基因，通過對其編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測BcAMT1;2基因組織表達(dá)模式，并在擬南芥中超表達(dá)該基因以驗(yàn)證其功能?！窘Y(jié)果】克隆的BcAMT1;2基因cDNA序列全長為1539 bp，編碼512個氨基酸殘基，蛋白分子量為54.90 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.03，無信號肽，有9個跨膜結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞膜上，為穩(wěn)定的兩性蛋白。BcAMT1;2蛋白歸屬于AMT1亞家族，具有AMT1的特征結(jié)構(gòu)域（DFAGSGVVHMVGGIAGLWGALIEGPR），與擬南芥AtAMT1;2蛋白的氨基酸序列相似性最高，為91.21%。BcAMT1;2基因在葉片中的表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），根和葉柄次之，而在莖中幾乎不表達(dá)。在0.25 mmol/L NH4+處理下，超表達(dá)BcAMT1;2基因的3個擬南芥株系的生物量（地上部鮮重和地下部鮮重）、主根長度和植株內(nèi)NH4+-N含量較野生型均顯著增加，而在20 mmol/L甲基胺（MeA）下，超表達(dá)BcAMT1;2基因的3個株系的株鮮重較野生型顯著降低，且表現(xiàn)出植株葉片黃化、根系生長受抑等毒害效應(yīng)?！窘Y(jié)論】BcAMT1;2基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，可調(diào)控NH4+及其類似物甲基胺的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，表明BcAMT1;2蛋白在小白菜對NH4+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞： 小白菜;銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AMT）;基因克隆;生物信息學(xué)分析;功能驗(yàn)證

中圖分類號： S634.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-2932-09

Molecular cloning，tissue expression specificity detection and functional analysis of AMT1;2 from Chinese cabbage Pak-Choi

LIU Jian-guo， GUO Ke-ting， XIAO Yan-hui， LIN Yu-xia， ZHU Yun-na*

（Henry Fok College of Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan， Guangdong? 512005， China）

Abstract：【Objective】In this paper，an ammonium transporter gene BcAMT1;2 was cloned from Chinese cabbage Pak-Choi，its bioinformatics and tissue expression characteristics were detected， and its function was analyzed， which provi-ded a the oretical basis for further studying the mechanism of BcAMT1;2 gene in NH4+ absorption and transportation in Chinese cabbagePak-Choi.【Method】Homologous cloning method was applied to clone BcAMT1;2 gene from Chinese cabbage Pak-Choi variety Shanghaiqing，then its biological information was carried out on its encoded protein. The expression of BcAMT1;2 gene was detected by real-time fluorescence quantitative PCR in different tissues of Chinese cabbage Pak-Choi，and the function of BcAMT1;2 was verified by overexpression BcAMT1;2 in Arabidopsis thaliana. 【Result】The open reading frame（ORF） of BcAMT1;2 gene was1539 bp，encoding 512 amino acids residues，with molecular weights of 54.90 kD，and theoretical isoelectric points （pI） of 8.03. In addition，BcAMT1;2 protein had no signal peptide，but had 9 transmembrane domains. Stability prediction indicated that BcAMT1;2 was stable amphipathic protein，and the subcellular localization prediction showed BcAMT1;2 might locate in the plasmalemma. Conserved domain analysis suggested that? BcAMT1;2 included the motif （DFAGSGVVHMVGGIAGLWGALIEGPR），which was the signature motif of AMT1 subfamily. Moreover，amino acid sequence alignment showed that BcAMT1;2 protein had the highest homology with AtAMT1;2 （91.21%） in A. thaliana，so BcAMT1;2 was one member of AMT1 subfamily. The expression level of BcAMT1;2 in leaf was significantly higher than in other tissues in Pak-Choi（P<0.05， the same below），followed by the ones of root and petiole，but almost no expression in stem. Under the treatment of 0.25 mmol/L NH4+，the biomass（the fresh weight of root and shoot），the length of primary root，and NH4+-N content of the whole plants were significantly increased in three lines of overexpressing BcAMT1;2，compared with the ones of wild type. At 20 mmol/L methylamine（MeA），the biomass of three lines of overexpressing BcAMT1;2 was significantly lower than that of wild type，with yellow leaves，short roots，and other symptoms of ammonia toxicity. 【Conclusion】BcAMT1;2 gene has obvious tissue specificity and can regulate the absorption and transportation of NH4+ and its analog methylamine， indicating that BcAMT1;2 protein may play an important role in the absorption and transport of NH4+ in Pak-Choi.

Key words： Chinese cabbage Pak-Choi; ammonium transporter （AMT）; gene cloning; bioinformatics analysis;functional verification

Foundation item： Guangdong Natural Science Foundation（2019A1515011680）; Education Department Project of Guangdong（2019KTSCX164）; Doctoral Research Startup Project of Shaoguan University （99000613）

0 引言

【研究意義】硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）是植物從土壤吸收的主要無機(jī)氮源，對作物生長發(fā)育和產(chǎn)量構(gòu)成極為重要，其中，NO3-是旱作土壤中氮的主要形式，NH4+是水淹或酸性土壤中氮的主要形式（李靜等，2012）。但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，無論是何種土壤類型，施用氮肥均會導(dǎo)致NH4+在短期內(nèi)成為主要形式（Xu and Takahashi，2020）。由于NH4+在同化和利用過程中消耗能量較NO3-少，故NH4+被認(rèn)為是優(yōu)勢氮源（Socci and Templer，2011）。但吸收過量NH4+會導(dǎo)致毒害效應(yīng)，如葉片變黃、生長受抑等。因此，將從土壤吸收的NH4+保持在適宜范圍內(nèi)對植物的生長尤為重要。植物主要通過銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ammonium transporter，AMT）吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)NH4+（Yuan et al.，2007;Hao et al.，2020）。因此，克隆AMT基因，分析其生物學(xué)功能，對提高小白菜氮素利用率及其分子育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已從水稻（Sonoda et al.，2003）、擬南芥（Loqué et al.，2006）、玉米（Gu et al.，2013）、海棠（Li et al.，2017）、芥藍(lán)（Song et al.，2017）、番茄（Filiz and Akbudak，2020）等多種植物中克隆獲得AMT基因。植物AMT蛋白分為AMT1和AMT2兩個亞家族。擬南芥的AMT1亞家族有5個成員，AMT2亞家族有1個成員（Yuan et al.，2007）。其中，AMT1亞家族成員具有不同表達(dá)特性，如AtAMT1;1、AtAMT1;2、AtAMT1;3和AtAMT1;5蛋白主要負(fù)責(zé)擬南芥根系對NH4+的吸收（Yuan et al.，2007）;AtAMT1;4蛋白主要負(fù)責(zé)花粉對NH4+的吸收，從而調(diào)控花粉的氮營養(yǎng)（Yuan et al.，2009）。AtAMT1;1和AtAMT1;3蛋白對底物親和性較高，負(fù)責(zé)吸收60%～70%的NH4+，AtAMT1;5蛋白負(fù)責(zé)吸收約10%的NH4+（Yuan et al.，2007）;AtAMT1;2蛋白對底物親和性較低，負(fù)責(zé)吸收18%～26%的NH4+，且將質(zhì)外體途徑中的NH4+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至維管束中（Yuan et al.，2007;Straub et al.，2017），也可將氮分配于地上部（Duan et al.，2018）。但八棱海棠中的MrAMT1;2基因在根系中高特異性表達(dá)，其編碼蛋白對底物的親和系數(shù)較高;MrAMT1;1和MrAMT1;3基因在根、葉等營養(yǎng)器官中均有表達(dá)，其編碼蛋白對底物的親和性均低于MrAMT1;2（Li et al.，2017）?？梢?，不同植物的AMT均對NH4+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮重要作用，但不同AMT家族成員的作用存在差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前鮮見有關(guān)小白菜AMT基因克隆及表達(dá)分析的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆小白菜AMT1;2基因（BcAMT1;2）全長序列，對其生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其組織特異性，并進(jìn)行功能驗(yàn)證，以期解析小白菜NH4+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的生物學(xué)功能，為深入研究小白菜AMT1;2蛋白對NH4+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的分子調(diào)控機(jī)制及小白菜氮素營養(yǎng)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試小白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino），品種為上海青（由河北省青縣純豐蔬菜良種繁育場繁育），種植于廣東省韶關(guān)市韶關(guān)學(xué)院生態(tài)園溫室。擬南芥Columbia-0（簡稱Col-0）為野生型。主要試劑：Eastep? Super總RNA提取試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司;PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Prime STAR Max DNA Polymerase、TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）和pMD20-T載體均購于寶生物工程（大連）有限公司;Clone Express?II One Step Cloning Kit、DNA凝膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101購于上海唯地生物技術(shù)有限公司。超表達(dá)載體為pCIAMBIA3301為韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。主要儀器設(shè)備：GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）、CFX connect TM Real-time PCR Detection System（Bio-Rad，美國）、T100 PCR儀（Bio-Rad，美國）、Nano-300微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 樣品采集 種子用2.5% NaClO消毒10 min，用蒸餾水沖洗4～5次，采用珍珠巖穴盤育苗，播種后15 d移栽，用1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)25 d后，取根、莖、葉、葉柄等組織，分別用液氮速凍，放在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 采用Eastep? Super植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA第一鏈。

1. 2. 3 基因克隆及陽性克隆鑒定 從NCBI數(shù)據(jù)庫搜索白菜AMT基因序列信息，得到注釋基因AMT1;2（XM_009113156.3）。根據(jù)其核苷酸序列，利用Pri-mer 5.0設(shè)計AMT1;2基因的特異引物（表1）。反應(yīng)體系20.0 μL，2×Prime STAR Max Premix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（A12）各1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.0 min，進(jìn)行35個循環(huán)，72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接至pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定后，挑取陽性克隆送廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1. 2. 4 生物信息學(xué)分析 將測序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，利用BLASTn在線工具進(jìn)行對核苷酸序列檢索比對。利用MEGA 6.0進(jìn)行多重比對和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建。利用ProtParam在線預(yù)測編碼蛋白的理化性質(zhì);以ProtScale分析蛋白的親疏水性;通過SOPMA在線分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)，借助Phyre2對蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并以Singal 4.1預(yù)測其信號肽;采用Protter進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測;采用Wolf Psort進(jìn)行亞細(xì)胞定位;利用WEBLOGO對蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1. 2. 5 qRT-PCR檢測 參照植物總RNA提取試劑盒說明分別提取小白菜根、莖、葉柄和葉片組織總RNA。參照PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明去除gDNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，用RNase-Free ddH2O稀釋10倍后作為模板，按照TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系為：2×TB Green TaqTM 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（表1）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，RNase Free H2O補(bǔ)充至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。以GADPH和Actin作為內(nèi)參基因，采用2-??Ct計算基因的相對表達(dá)量，統(tǒng)計分析用t檢驗(yàn)。

1. 2. 6 功能驗(yàn)證 利用Clone Express?II One Step Cloning Kit將BcAMT1;2基因cDNA序列連接至植物表達(dá)載體pCAMBIA3301，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后，然后浸染擬南芥Col-0的花序，通過轉(zhuǎn)基因篩選獲得T2代種子，用于功能驗(yàn)證。擬南芥種子用2.5% NaClO消毒10 min后，用無菌水沖洗5遍，播種于1/2劑量改良Murashige & Skoog培養(yǎng)基上（MS，氮源為4 mmol/L NaNO3，pH 6.0）進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。生長環(huán)境條件：光照條件下25 ℃/黑暗條件下23 ℃;光周期為光照16 h/黑暗8 h。預(yù)培養(yǎng)4 d后，挑選整齊一致幼苗移至含不同N源[0.25 mmol/L NH4+、20 mmol/L甲基胺（MeA）]的方形培養(yǎng)皿（長×寬×高為10 cm×10 cm×1.5 cm）中生長，移植后10～14 d觀察擬南芥野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因植株的表型和生長情況，測定其生物量、主根長和植株內(nèi)NH4+-N含量等指標(biāo)。

1. 3 統(tǒng)計分析

利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 19.0進(jìn)行Duncan’s顯著性分析，利用SigmaPlot 11.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 基因克隆及序列分析結(jié)果

利用同源克隆方法，以小白菜cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條約1500 bp的條帶（圖1）。測序結(jié)果顯示，該片段長度為1539 bp，將其提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示該片段與擬南芥AtAMT1;2基因的相似性為85.85%，與油菜BnAMT1;2的相似性達(dá)99.61%，表明該片段為小白菜的AMT1;2基因，縮寫為BcAMT1;2。

2. 2 理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果

ProtParam預(yù)測結(jié)果顯示，BcAMT1;2基因編碼512個氨基酸殘基，由20種氨基酸組成，其中甘氨酸（Gly）含量最高（占11.5%），半胱氨酸（Cys）含量最低（占1.6%）;帶正電氨基酸殘基數(shù)為32個，帶負(fù)電氨基酸殘基數(shù)為30個;BcAMT1;2蛋白的分子量為54.90 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.03，原子組成為C2518H3792N640O702S20。BcAMT1;2蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為24.28，為穩(wěn)定蛋白。ProtScale預(yù)測結(jié)果（圖2）顯示， BcAMT1;2蛋白既有疏水區(qū)，也有親水區(qū)，為兩性蛋白。Protter預(yù)測結(jié)果（圖3）顯示，BcAMT1;2蛋白為跨膜蛋白，共有9個跨膜區(qū)，其中，N端位于細(xì)胞膜外側(cè)，而C端位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，為跨膜蛋白。Wolf Psort預(yù)測結(jié)果顯示，BcAMT1;2蛋白定位于細(xì)胞膜上。通過SignalP 4.0預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)BcAMT1;2蛋白無信號肽序列（圖4），說明該蛋白為非分泌型蛋白。

2. 3 二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

SOPMA預(yù)測結(jié)果（圖5）顯示，BcAMT1;2蛋白的二級結(jié)構(gòu)由42.97%的α-螺旋（Alpha helix）、20.51%的β-折疊（Extended strand）、4.88%的β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）和31.64%的隨機(jī)卷曲（Random coil）組成。Phyre2對蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果（圖6）顯示，BcAMT1;2蛋白主要部分為α-螺旋，與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果一致。此外， BcAMT1;2與擬南芥AtAMT1;2的三級結(jié)構(gòu)也較相似（圖6），推測兩者具有相似的生物學(xué)功能。

2. 4 多重比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將BcAMT1;2、擬南芥AtAMT1;2、番茄LeAMT1;2、煙草NtAMT1;2和水稻OsAMT1;2進(jìn)行氨基酸序列多重比對分析，結(jié)果如圖7所示。BcAMT1;2蛋白與其他植物AMT1;2蛋白均含有保守結(jié)構(gòu)域。基于不同植物AMT1;2氨基酸序列的相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖8-A）顯示，植物AMT蛋白可分為兩大基因亞家族，即AMT1和AMT2;各類群物種的AMT1或AMT2間的蛋白親緣關(guān)系較近，其中，BcAMT1;2蛋白與同為十字花科植物的擬南芥AtAMT1;2蛋白的親緣關(guān)系最近，二者氨基酸序列的相似性為91.21%。

利用WEBLOGO分別對AMT1和AMT2亞家族成員的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明AMT1成員中包含1個保守結(jié)構(gòu)域（D214-F-A-G-S-G-V-V-H-M（L）-V-G-G-I（V）-A-G-L-W（G）-G-A-L（F）-I（V）-E-G-P-R239）、AMT2成員包含另一個保守結(jié)構(gòu)域（D214-Y（F）-S（A/G）-G-G-Y-V-I-H-L（V）-S-S（A）-G-V（I）-A-G-F（L/V）-T（V）-A（T）-A-Y-W-V-G-P-R239）（圖8-B），均為AMT特征結(jié)構(gòu)域。

2. 5 BcAMT1;2基因在小白菜不同組織特異性分析

由圖9可知，BcAMT1;2基因在小白菜不同組織中均有表達(dá)，但其表達(dá)水平存在明顯差異。BcAMT1;2基因在小白菜葉片中的相對表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），在根中的相對表達(dá)量次之，而在莖中幾乎不表達(dá)，表明BcAMT1;2基因表達(dá)具有明顯的組織特異性。

2. 6 BcAMT1;2基因功能驗(yàn)證結(jié)果

將BcAMT1;2基因?qū)朕r(nóng)桿菌GV3101后，侵染擬南芥花序，通過篩選獲得T2代超表達(dá)BcAMT1;2基因擬南芥植株。從圖10-A可看出，與野生型（WT）相比，超表達(dá)BcAMT1;2基因的3個株系12-4、12-6和12-9的地上部鮮重和地下部鮮重均顯著增加，增幅分別為11.3%～16.5%和33.3%～37.3%（圖10-A和圖10-B），且主根長度和植株內(nèi)NH4+-N含量也顯著增加，增幅分別為7.5%～12.8%和17.9%～32.0%（圖10-C和圖10-D）。

MeA為NH4+的有毒化學(xué)類似物，過量吸收可造成細(xì)胞死亡（叢郁等，2013）。通過MeA敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，超表達(dá)BcAMT1;2基因的3個株系植株鮮重顯著降低（圖11-A和圖11-B），植株葉片黃化、根系生長受抑等毒害效應(yīng)，表明超表達(dá)BcAMT1;2基因可促進(jìn)擬南芥對MeA的吸收。

終上所述，擬南芥中超表達(dá)BcAMT1;2基因可增加植株體內(nèi)NH4+-N含量，推測BcAMT1;2與擬南芥AtAMT1;2蛋白在NH4+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中具有相似生物學(xué)功能（Yuan et al.，2007）。

3 討論

本研究利用同源克隆方法從小白菜中獲得BcAMT1;2基因，cDNA全長序列1539 bp，編碼512個氨基酸殘基，定位于細(xì)胞膜上，符合植物銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為膜蛋白的基本特征（Loqué and Von Wirén，2004;Mcdonald et al.，2012）。BcAMT1;2蛋白具有9個跨膜結(jié)構(gòu)域，與Ye等（2016）報道的AMT蛋白一般包含9～12個跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)論基本一致。AMT1和AMT2基因亞家族分別含有各自的保守結(jié)構(gòu)域，位于第5個或第6個跨膜區(qū)上（Saier，1998），保守的特征結(jié)構(gòu)域可用于鑒別其他植物AMT亞家族成員（Couturier et al.，2007），而BcAMT1;2在第5個跨膜區(qū)包含“DFAGSGVVHMVGGIAGLWGALIEGPR”，具有植物AMT1亞家族的特征結(jié)構(gòu)域，表明BcAMT1;2屬于AMT1亞家族。此外，BcAMT1;2蛋白與擬南芥AtAMT1;2的氨基酸序列相似性最高，為91.21%，且二者具有相似的三級結(jié)構(gòu)，推測BcAMT1;2具有與擬南芥AtAMT1;2蛋白相似的生物學(xué)功能。

不同植物AMTs基因在不同組織部位的表達(dá)模式不同。擬南芥AtAMT1;2基因在根和葉中均有表達(dá)，而AtAMT1;3基因在根系特異表達(dá)（Yuan et al.，2007）;在八棱海棠中，MrAMT1;1和MrAMT1;3基因在根和葉中均有表達(dá)，而MrAMT1;2基因在根系特異表達(dá)（Li et al.，2017）;CsAMT1;2基因在茶樹根部特異表達(dá)而在葉片幾乎不表達(dá)（張文婧等，2020）。本研究結(jié)果顯示，BcAMT1;2基因在葉片中表達(dá)最強(qiáng)，在根中表達(dá)次之，而在莖和葉柄中表達(dá)微弱。這與番茄（von Wirén et al.，2000）、油菜（Pearson et al.，2002）、擬南芥（Yuan et al.，2007）中的結(jié)果相似，推測AMT在葉片中高表達(dá)可能與植物氮素循環(huán)再利用有關(guān)，但與八棱海棠MrAMT1;2基因（Li et al.，2017）、茶樹CsAMT1;2基因（張文婧等，2020）的表達(dá)特性不同?？梢?，不同物種AMT同源基因表達(dá)特性也存在差異，可能與不同物種的同源基因在適應(yīng)環(huán)境時進(jìn)化出的不同生理功能有關(guān)（Li et al.，2017）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證BcAMT1;2基因的功能，本研究在擬南芥中超表達(dá)該基因。在0.25 mmol/L NH4+處理下，與野生型相比，超表達(dá)BcAMT1;2基因顯著提高擬南芥植株體內(nèi)NH4+-N含量，且增加主根長度和植株生物量;與野生型相比，超表達(dá)BcAMT1;2基因促進(jìn)擬南芥對銨類似物MeA的吸收。由此可見，本研究克隆的BcAMT1;2基因編碼蛋白具有轉(zhuǎn)銨功能。這與Yuan等（2007）、Duan等（2018）的研究結(jié)果一致。除NH4+是AMT的轉(zhuǎn)運(yùn)底物外，NH3也是其轉(zhuǎn)運(yùn)底物。Neuh?user和Ludewig（2014）利用電化學(xué)技術(shù)證明擬南芥AtAMT1;2還具有NH3/H+共轉(zhuǎn)運(yùn)功能，通過改變NH3和H+轉(zhuǎn)運(yùn)耦合而影響NH3的轉(zhuǎn)運(yùn)，在不同H+耦合比例下，AMT/Rh蛋白可能具有通用的NH3轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。今后還需通過構(gòu)建BcAMT1;2超表達(dá)或基因敲除的小白菜轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步研究AMT在NH4+/NH3的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用及分子機(jī)制，為研究植物對NH4+/NH3的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控提供理論參考。

4 結(jié)論

BcAMT1;2基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，可調(diào)控NH4+及其類似物甲基胺的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，表明BcAMT1;2在NH4+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要作用。

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收稿日期：2021-02-02

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2019A1515011680）;廣東省教育廳項(xiàng)目（2019KTSCX164）;韶關(guān)學(xué)院博士科研啟動項(xiàng)目（99000613）

通訊作者：朱云娜（1982-），https：//orcid.org/0000-0001-5849-3598，博士，主要從事蔬菜生理與分子生物學(xué)研究工作，E-mail：zhuyn326@126.com

第一作者：劉建國（1981-），https：//orcid.org/0000-0001-5095-6412，主要從事園藝生理生態(tài)研究工作，E-mail：jgliu@sgu.edu.cn