莫澤君 陳小翔 蒲媛媛 段麗麗 田宗林 滕建輝 羅雯 闕遠慧 劉仁祥

基于DIA LC-MS的煙草根尖蛋白質(zhì)樣品

檢測分析

莫澤君1，2，陳小翔3，蒲媛媛1，2，段麗麗1，2，田宗林2，4，滕建輝2，4，

羅 雯2，4，闕遠慧2，4，劉仁祥2，4*

（1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院 貴陽 550025;2貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴陽 550025;3浙江中煙工業(yè)有限責任公司，

杭州 310000;4貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴陽 550025）

摘要：【目的】分析數(shù)據(jù)非依賴性采集高分辨率色譜—質(zhì)譜技術(shù)（DIA LC-MS）對根尖差異蛋白質(zhì)樣品檢測的適用性，為深入研究煙草蛋白質(zhì)組學(xué)提供技術(shù)支撐?！痉椒ā恳?個煙草品種（系）移栽后74 d的根尖組織為試驗材料，采用DIA LC-MS法對裂解的蛋白質(zhì)肽段進行掃描，從而分析該方法對根樣組織的適用性?！窘Y(jié)果】采用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖總蛋白質(zhì)，能得到橫向條帶平行性好，電泳條帶清晰的蛋白質(zhì)樣品，樣品等級評價均達到A級。構(gòu)建的DDA數(shù)據(jù)庫包含28042條肽段，共鑒定出7084個蛋白質(zhì)。DIA數(shù)據(jù)的色譜峰平均數(shù)據(jù)點為7，平均的峰容量達260，主要肽段的保留時間（iRT）均被檢測出，且整體較穩(wěn)定，在Q值為0.01標準下的一致性評分（Cscore）為0.948，變異系數(shù)（CV）中值為11.5%（小于20.0%），相關(guān)系數(shù)大于0.9。DIA全息掃描模式下從6個煙草品種（系）的根尖組織中鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)目為4149～5069個?！窘Y(jié)論】DIA LC-MS分析鑒定的蛋白質(zhì)范圍廣、數(shù)量大、可信度高，具有一定的可靠性和穩(wěn)定性，各項質(zhì)控指標均能達到試驗分析要求，說明DIA LC-MS適用于煙草根尖蛋白質(zhì)組樣品的檢測分析。

關(guān)鍵詞： 煙草;DIA LC-MS;根尖;蛋白質(zhì);檢測;適應(yīng)性

中圖分類號：S572.035.3? ? ? ? ? ?   ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-2962-07

Detection and analysis of protein samples of tobacco root tip tissue based on DIA LC-MS

MO Ze-jun1，2， CHEN Xiao-xiang3， PU Yuan-yuan1，2， DUAN Li-li1，2， TIAN Zong-lin2，4，TENG Jian-hui2，4， LUO Wen2，4， QUE Yuan-hui2，4， LIU Ren-xiang2，4*

（ 1College of Agricultural， Guizhou University， Guiyang? 550025， China; 2Key Laboratory of Tobacco Quality in Guizhou Province，Guiyang? 550025， China; 3Zhejiang Zhongyan Industry Co.，Ltd.， Hangzhou? 310000， China; 4College of Tobacco，Guizhou University， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】The applicability of data-independent acquisition high-resolution chromatography-mass spectrometry （DIA LC-MS） for the detection of differential protein samples in root tips was analyzed to provide technical support for in-depth study of tobacco proteomics. 【Method】The root tip tissue of 6 tobacco varieties （lines） was used as the test material at 74 d after transplantation， and the cleaved protein peptides were scanned by DIA LC-MS method to analyze the applicability of this method to root-like tissue. 【Result】The total protein of root apex was extracted by TCA/acetone precipitation + SDT lysis method， and protein samples with good parallelism of horizontal bands and clear electrophoresis bands were obtained， and the sample grade evaluation all reached grade A.The constructed DDA database contained 28042 peptides， and a total of 7084 proteins were identified. The average chromatogram peak of the data was 7， the average peak capacity was 260， the main retention time（iRT） was detected， and the retention time was generally stable， the consistency score（Cscore） was 0.948 under the Q value of 0.01 standard， the median coefficient of variation（CV） was 11.5% （less than 20.0%）， and the correlation coefficient was greater than 0.9. The total number of proteins identified from the root tip tissue of six tobacco varieties （lines） under DIA holographic scanning mode ranged from 4149 to 5069.【Conclusion】The proteins identified by DIA LC-MS analysis have a wide range， a large number， high relia-bility， and certain reliability and stability. All quality control indicators can meet the requirements of experimental analysis， indicating that DIA LC-MS is suitable for detection and analysis of proteomic samples from tobacco root tips.

Key words： tobacco; root tip tissue; protein; DIA LC-MS; detection; adaptability

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（32060510）; Science and Technology Department Project of Guizhou （〔2016〕5663）;Science and Technology Department Project of Guizhou （〔2019〕1405）

0 引言

【研究意義】煙草是廣泛栽培的特種經(jīng)濟作物，也是遺傳背景較清晰的模式植物（劉強等，2020）。煙草根系作為煙株最重要的器官之一，對煙草的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用（張玉濤等，2012;張琳等，2019）。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，從整體水平上研究生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)組成及其生命活動規(guī)律，已成為了解基因功能的另一新途徑（韓平安，2016）。因此，探索煙草根尖蛋白質(zhì)樣品的提取方法及質(zhì)譜定性和定量檢測技術(shù)，對于從蛋白質(zhì)水平尋找煙草根組織的生物標志物質(zhì)，研究煙草生命活動規(guī)律具有重大意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，質(zhì)譜儀器可按照數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）的形式進行掃描，實現(xiàn)高通量檢測和質(zhì)譜絕對定量（Tsou et al.，2015;牟永瑩等，2017;Demichev et al.，2020）。張譯元等（2021）基于DIA技術(shù)對轉(zhuǎn)IGF-I基因細毛羊皮膚組織進行蛋白組學(xué)分析，結(jié)果篩選出18個與羊毛性狀相關(guān)的差異蛋白及8條與羊毛生長發(fā)育相關(guān)的信號通路，為探明羊毛性狀的分子調(diào)控機理及分子標記育種提供參考依據(jù)。Guo等（2015）采用PCT-DIA技術(shù)將來自9個腎癌病人的18個組織切片分別轉(zhuǎn)化為DIA多肽離子碎片譜圖，并根據(jù)譜圖對2000個蛋白樣本進行定性和定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎組織切片的蛋白質(zhì)組測序結(jié)果具有很好的重復(fù)性，而且能完全將腎癌病人和健康人，以及不同組織形態(tài)的腎癌亞型區(qū)分開來。Yu（2019）通過DIA技術(shù)和抗體微陣列技術(shù)，對銀屑病治療前、銀屑病中藥治療后、健康對照共50例血清樣本建立蛋白質(zhì)表達譜，結(jié)果鑒定出106種參與血液凝固、炎癥、細胞凋亡和血管生成等銀屑病相關(guān)生物過程的差異蛋白，其中58種蛋白可區(qū)分健康組和銀屑病患者，12種蛋白可預(yù)測中藥治療效果，3個血清蛋白與銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)評分呈正相關(guān)。可見，DIA技術(shù)的發(fā)展對生物標志物的篩選具有重大意義。但對于植物根系的蛋白質(zhì)提取及分析多采用數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）的掃描方式（肖爽，2020），該方法存在掃描粗獷，覆蓋率低，樣品數(shù)據(jù)質(zhì)量偏低等問題，難以滿足試驗需求（王震，2016）?！颈狙芯康那腥朦c】煙草作為生物技術(shù)研究的模式植物，但目前鮮見應(yīng)用數(shù)據(jù)非依賴性采集高分辨率色譜—質(zhì)譜技術(shù)（DIA LC-MS）方法分析根系蛋白質(zhì)組表達情況的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以6個煙草品種（系）的根尖組織為試驗樣品，采用DIA技術(shù)對裂解的蛋白質(zhì)肽段進行掃描分析，探討DIA LC-MS法對根樣組織的適用性，為深入研究煙草根系的蛋白質(zhì)組學(xué)提供更高效分析方法。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

選用K326、青梗、Va116、Basma、K326×青梗和Va116×Basma為試驗材料，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。主要試劑：BCA蛋白濃度測定試劑盒（5000201）購自Bio-Rad公司;胰蛋白酶（V5113）購自Promega公司;iRT試劑盒（Ki-3002-2）購自Biognosys公司。主要儀器設(shè)備：高效液相色譜（LC-10AT）購自Shimadzu公司;安捷倫多重親和力去除系統(tǒng)（1200）購自Agilent公司;EASY-nLCTM1200納米液相色譜系統(tǒng)（LC140）和Q-Exactive HF-X識別系統(tǒng)（EXR0726042）購自Thermo公司;EASY-SprayTM C18色譜柱（ES802A）購自Thermo Scientific公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 田間試驗 田間試驗于2019年在貴州大學(xué)煙草科研基地開展。當年2月25日播種，5月1日移栽至大田，采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置3次重復(fù)，每小區(qū)3行，每行15株，共45株，行株距：110 cm×55 cm。大田管理措施與當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙栽培措施一致。移栽后74 d進行取樣，取樣部位為煙草幼嫩根尖。每小區(qū)隨機取3株混合，為避免外源污染，用純凈水清洗干凈后，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗。根尖樣品等量均勻混合后，置于不同滅菌離心管中，先用液氮冷凍，并立即置于-80 ℃低溫冰箱保存。

1. 2. 2 蛋白質(zhì)樣品制備 蛋白質(zhì)樣品的制備采用TCA-丙酮沉淀法。具體操作參見Thierry（2002）、范龍泉等（2012）的方法進行。

1. 2. 3 蛋白質(zhì)濃度測定 參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白質(zhì)濃度測定。

1. 2. 4 蛋白質(zhì)酶解及肽段濃度測定 參照李升升（2019）、徐昊（2019）的方法進行蛋白質(zhì)酶解。采用紫外光吸收法（280 nm）測定肽段濃度。取100 μg高豐度分離后的低豐度肽段，采用HPRP方法進行分級，收集所有組分。每個組分肽段凍干后，用10 μL 0.1% FA復(fù)溶肽段，并測定肽段濃度。然后分別取出2 μg肽段，摻入適量保留時間（iRT）標準肽段進行DDA質(zhì)譜檢測，每個組分質(zhì)譜分析時長90 min。

1. 2. 5 質(zhì)譜檢測方法 DDA分析采用納升流速HPLC系統(tǒng)Easy nLC-1200進行色譜分離。質(zhì)譜檢測及DIA分析參照周淦（2016）、李?。?017）的方法等進行。

1. 2. 6 LC-MS/MS及數(shù)據(jù)分析方法 DDA數(shù)據(jù)采用Maxquant（Maxquant_1.5.3.17）進行數(shù)據(jù)庫檢索，采用Tobacoo_uniprot下載數(shù)據(jù)庫，并將iRT肽段序列添加到數(shù)據(jù)庫中。參數(shù)設(shè)置參照邵若玄等（2018）、傅龍龍（2019）的方法進行。數(shù)據(jù)庫檢索鑒定到的蛋白必須通過設(shè)定的過濾參數(shù)，即錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<1%。將原始RAW文件和搜庫結(jié)果導(dǎo)入Spectronaut軟件構(gòu)建質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，并采用Spectronaut Pulsar X_12.0.20491.4進行DIA數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)庫與建庫所用數(shù)據(jù)庫相同。參數(shù)設(shè)置如下：retention time prediction type設(shè)為dynamic iRT;interference on MS2 level correction設(shè)為enabled;cross run normalization設(shè)為enabled，所有結(jié)果必須通過設(shè)定的過濾參數(shù)Q value cutoff為0.01（相當于FDR<1%）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 樣品總蛋白提取質(zhì)量檢測結(jié)果

提取高質(zhì)量的植物樣品蛋白質(zhì)是后續(xù)構(gòu)建數(shù)據(jù)庫及準確鑒定蛋白質(zhì)的先決條件，要求提取的蛋白質(zhì)樣品損失小，降解率低，非蛋白雜質(zhì)少，溶解度高，釋放盡可能多的肽段。本研究采用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖全蛋白，取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。樣品中含有分子量在25～66.2 kD之間的高豐度蛋白，橫向條帶平行性好，電泳條帶清晰，說明樣品間一致性較好，提取的蛋白質(zhì)量滿足試驗要求。

2. 2 根尖蛋白濃度測定結(jié)果

蛋白質(zhì)濃度的測定可為后期質(zhì)譜檢測中樣品上樣量的確定提供依據(jù)。由根尖樣品總蛋白質(zhì)提取結(jié)果（表1）可知，6個供試材料的蛋白質(zhì)濃度為2.3983～2.8875 μg/μL，20 μg樣品的總體積在7.1874～8.8313 μL，差異較小，樣品等級均為A級，滿足上樣量需求。

2. 3 蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建結(jié)果

DIA采用全息掃描模式獲得的圖譜極其復(fù)雜，難以和當前數(shù)據(jù)庫進行直接比對，從而無法完成蛋白質(zhì)的定性。因此，需對實際樣本進行深度DAA分析，以獲得實際樣本的質(zhì)譜圖庫。本研究共檢測到28042條肽段，共鑒定得到7084個蛋白質(zhì)，表明構(gòu)建的DDA數(shù)據(jù)庫信息資源豐富，對提高后續(xù)蛋白質(zhì)鑒定的準確性和定量數(shù)目具有重大意義。

2. 4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢測分析結(jié)果

要評價某個方法對實驗樣本的適用性，首先需要對得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制分析。一般的評價指標有平均數(shù)據(jù)點、峰容量、肽段的iRT及FDR等。由質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)控分析可看出，DIA數(shù)據(jù)的色譜峰平均數(shù)據(jù)點為7（圖2），平均的峰容量達260（圖3），主要肽段的iRT均被檢測出，并且整體較穩(wěn)定（圖4），在Q值為0.01標準下的一致性得分（Concensus Score，Cscore）為0.948（圖5），QC樣品（一般為所有樣本的混樣）變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）中值為11.5%（小于20.0%），相關(guān)系數(shù)大于0.9（圖6和圖7）。

2. 5 蛋白質(zhì)的定性檢測結(jié)果

DIA分析結(jié)果（圖8）顯示，6個供試材料的蛋白質(zhì)數(shù)量存在差異。Va116×Basma、Va116和Basma中鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量較多，達到5069和5064個;K326和青梗的蛋白質(zhì)數(shù)量最少，分別為4638和4149個;2個雜交種材料的蛋白質(zhì)數(shù)量居中，分別為4946和4721個。可見，DIA全息掃描模式下鑒定的蛋白質(zhì)范圍廣、數(shù)量大、可信度高，供試材料的蛋白質(zhì)較豐富。

3 討論

3. 1 根尖蛋白質(zhì)樣品的提取方法

由于煙草根系組織中含有大量的色素、氧化酶、糖、酯類、多酚類及其他次生代謝物質(zhì)，使得蛋白質(zhì)的提取較為困難，因此，在進行蛋白質(zhì)提取時要盡可能地去除樣品中的雜質(zhì)成分（李浩，2007;王潤潤等，2019）。林世峰等（2012）以煙草K326的生長期根系為材料，通過比較4種蛋白質(zhì)提取方法，結(jié)果表明酚提取法更適合于幼嫩根系的蛋白質(zhì)提取，TCA/丙酮沉淀法易使樣品降解，且高分子量的蛋白易丟失。在黃瓜根系研究中TCA/丙酮沉淀法能獲得較好的凝膠圖譜（王珊珊等，2012），但在棉花根系相關(guān)研究中，此法并不是最佳方法（王曼等，2015）?？梢?，不同作物因其自身特性，所適用的蛋白質(zhì)提取方法也不同。本研究使用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖全蛋白，得到分子量介于25～66.2 kD的高豐度蛋白，且樣品蛋白電泳條帶清晰?？梢?，核酸和脂蛋白的影響小，雜質(zhì)少，表明TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法適用于煙草根尖組織的蛋白質(zhì)提取。

3. 2 蛋白質(zhì)的定性分析

對復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)進行定性是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個重要目標，蛋白質(zhì)定性的準確性對后期生物標志物的篩選具有重要意義。采用傳統(tǒng)的DDA方法，唐秀英等（2019）通過比較常溫與低溫處理下水稻苗期根系蛋白質(zhì)組，共獲得可信肽段數(shù)12673條，鑒定的蛋白數(shù)量為3346個;高文霞等（2021）對青枯菌接種3 h的D101煙苗根系進行蛋白組分析，共鑒定到6762個蛋白質(zhì)。本研究應(yīng)用DIA蛋白質(zhì)組學(xué)方法，首先對所有樣本的混合進行樣品酶解和HPRP分級，經(jīng)過DDA分析，使用MaxQuant進行數(shù)據(jù)庫檢索鑒定，利用Spectronaut pulsar X軟件構(gòu)建圖譜庫，建立了DIA 數(shù)據(jù)庫，其中包含28042條肽段，鑒定出7084個蛋白質(zhì)，在不同比較組中篩選到大量差異表達蛋白?？梢?，采用DIA LC-MS方法構(gòu)建的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫信息資源豐富，對提高后續(xù)蛋白質(zhì)鑒定的準確性和定量數(shù)目具有重要意義，得到的差異表達蛋白可為生物性狀標記物的篩選提供相關(guān)參考依據(jù)。

4 結(jié)論

DIA LC-MS分析鑒定的蛋白質(zhì)范圍廣、數(shù)量大、可信度高，具有一定的可靠性和穩(wěn)定性，各項質(zhì)控指標均能達到試驗分析要求，說明DIA LC-MS適用于煙草根尖蛋白質(zhì)組樣品的檢測分析。

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收稿日期：2021-01-08

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32060510）;貴州省科技廳項目（〔2016〕5663）;貴州省科技廳項目（〔2019〕1405）

通訊作者：劉仁祥（1971-），https：//orcid.org/0000-0003-4562-8507，教授，主要從事煙草遺傳育種研究工作，E-mail：rxliu@gzu.edu.cn

第一作者：莫澤君（1994-），https：//orcid.org/0000-0002-4251-9922，研究方向為作物遺傳育種，E-mail：mojun11@foxmail.com