張瀚之，席德州，，王 歡，黃永光，*，尤小龍，胡 峰，邱樹毅

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564600）

醬香型白酒是中國三大典型香型之一，在中國食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展中占有非常重要的地位。2020年，遵義規(guī)模以上企業(yè)白酒產(chǎn)量達(dá)到24.5萬kL，工業(yè)增加值達(dá)1 129億元，占全市工業(yè)增加值的77%[1]，對(duì)貴州的經(jīng)濟(jì)建設(shè)貢獻(xiàn)極大，是名副其實(shí)的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)。而醬香型白酒又因其“四高兩長”的獨(dú)特的釀造工藝（即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫流酒和生產(chǎn)周期長、貯存期長），擁有獨(dú)特的風(fēng)格特征，始終占據(jù)著高端白酒的市場(chǎng)規(guī)模。其中，高溫堆積是醬香型白酒特有的釀造工藝，大量釀造環(huán)境中的微生物在此過程中富集，為窖池發(fā)酵提供了大量的微生物儲(chǔ)備、酶類資源和香味物質(zhì)及其前體物質(zhì)[2]，保證醬香型白酒的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，醬香型白酒的生產(chǎn)領(lǐng)域一直存在著“無堆積，不產(chǎn)酒”的說法[3]。堆積發(fā)酵采用開放式的固態(tài)發(fā)酵模式，微生物是其過程的主導(dǎo)者。其中，真菌在此過程中提供了源源不斷的酶類資源，為糖化和發(fā)酵提供動(dòng)力，特別是酵母菌，其數(shù)量和種類在堆積前后有大幅增加[4]，這在很大程度上彌補(bǔ)了高溫大曲中酵母數(shù)量少而導(dǎo)致的發(fā)酵力不足的缺陷，保證了醬香型白酒的正常生產(chǎn)。因此，堆積發(fā)酵中真菌的菌群結(jié)構(gòu)一直以來是眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)[5-7]。黃永光等[8]通過分離培養(yǎng)基分析堆積酒醅不同層面的酵母群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)堆積上層的酵母數(shù)量要多于中下層，堆積中心的酵母數(shù)量在發(fā)酵初期多于表層，而發(fā)酵后期則因氧含量等參數(shù)變化導(dǎo)致外層酵母多于中心點(diǎn)，該結(jié)果初步揭示了堆積過程中的酵母群落結(jié)構(gòu)的變化。然而，通過可培養(yǎng)只能認(rèn)識(shí)發(fā)酵酒醅中1%～10%的微生物，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能準(zhǔn)確反映發(fā)酵體系中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化。因此，必須應(yīng)用現(xiàn)代研究技術(shù)分析釀造微生物體系，而高通量測(cè)序技術(shù)近年來被廣泛應(yīng)用于解析微生物群落結(jié)構(gòu)變化[9]。

在醬香型白酒堆積發(fā)酵過程中，黃蘊(yùn)利等[10]采用高通量測(cè)序方法研究了醬香型白酒第二輪次發(fā)酵酒醅中的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)堆積酒醅中的優(yōu)勢(shì)真菌屬主要為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、假絲酵母屬（Candida）和曲霉屬（Aspergillus）；郭敏等[11]運(yùn)用高通量測(cè)序方法研究了醬香型白酒第三輪次和第七輪次的發(fā)酵酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)，三輪次的優(yōu)勢(shì)真菌屬為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces），七輪次酒醅的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為隱球菌屬（Cryptococcus），且兩個(gè)輪次酒醅的微生態(tài)多樣性存在差異。上述研究初步揭示了醬香型白酒堆積發(fā)酵過程中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，但主要集中在單一的輪次或者傳統(tǒng)的釀造過程。而醬香型白酒的堆積發(fā)酵工藝因一直沿襲傳統(tǒng)的人工上堆模式，勞動(dòng)強(qiáng)度大，可控性較差，容易受環(huán)境因素和人為操作差異的影響。而其他香型，如濃香型[15]、清香型[16]白酒的機(jī)械化表明，機(jī)械化釀造不僅降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，還保證了釀造質(zhì)量的可控性。因此，在機(jī)械化發(fā)展的大趨勢(shì)下，醬香型白酒需要改變生產(chǎn)方式、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品品質(zhì)、發(fā)展安全高產(chǎn)的機(jī)械化釀造模式，實(shí)現(xiàn)跨越式發(fā)展。其中，機(jī)械化堆積發(fā)酵過程中細(xì)菌的微生物菌群結(jié)構(gòu)本課題組已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)的報(bào)道[12]。

基于此，本研究以醬香型白酒釀造機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵過程中的發(fā)酵酒醅為樣品，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒機(jī)械化堆積發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)特征及其與發(fā)酵環(huán)境因子的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究，全面的解析醬香型白酒機(jī)械化釀造時(shí)，堆積發(fā)酵過程的真菌結(jié)構(gòu)和主導(dǎo)性真菌菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，進(jìn)一步為研究其發(fā)酵機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為醬香型白酒機(jī)械化釀造提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：采集于貴州XJ公司醬香型白酒機(jī)械化制酒車間1～7輪次堆積發(fā)酵的酒醅，標(biāo)記為1DJ～7DJ；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：美國OmegaBio-Tek公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增引物：北京全式金生物技術(shù)有限公司；凝膠提取試劑盒：美國Axygen Biosciences公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HeraeusMultifugeX1R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；E002092超凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；HQ-60-II渦旋振蕩器；ABI Gene AmpR9700 PCR儀：美國伯樂公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像系統(tǒng)：上海培清科技有限公司；Zealway G154DW高壓蒸汽滅菌鍋：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

樣品的采集參考王歡等[12]方法。采集周期為1 d，從收堆后開始采集，直至堆積發(fā)酵堆的表層的酒醅溫度達(dá)50 ℃時(shí)結(jié)束。由于不同輪次酒醅堆積時(shí)間不同，最終1～7輪次酒醅分別堆積3 d、6 d、6 d、4 d、3 d、2 d、2 d。以一輪次為例說明取樣情況，如圖1所示，采取同一天的A點(diǎn)（堆積發(fā)酵堆上層中點(diǎn)），B、C點(diǎn)（中層堆中心和堆表層部位的內(nèi)表層），D、E點(diǎn)（下層堆中心和堆表層部位的內(nèi)表層）后，立即用無菌袋包裝，并將采集的所有樣品均勻混合，-20 ℃保存。再將上述同一輪次酒醅的采集樣品等份量混合均為1個(gè)樣品（一天所采5個(gè)單樣品等量混合均勻代表一天采集酒醅的樣品，再將每一輪次酒醅每一天采集的樣品再次等量混合均勻作為該輪次堆積樣品），最終，1～7輪次酒醅共獲得7個(gè)最終混合樣品（本研究1～7輪次酒醅總共取樣26 d，編號(hào)為1DJ～7DJ，每輪次取5個(gè)點(diǎn)，共采集酒醅樣品130個(gè)小樣）。

圖1 堆積酒醅取樣示意圖Fig. 1 Schematic diagram of sampling of stacked fermented grains

1.3.2 DNA提取

DNA提取前處理的方法與文獻(xiàn)[12]一致。具體的酒醅總DNA提取步驟參考土壤DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）操作說明書。

1.3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增及Illumina Hi Seq高通量測(cè)序

采用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGAGAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）PCR擴(kuò)增ITS區(qū)基因序列。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：0.8 μL正向引物，0.8 μL反向引物，2 μL 10×Buffer，2 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTP），0.2 μLrTaqDNA聚合酶，2 μL模板DNA和12.2 μL無菌雙蒸水（ddH2O）。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共循環(huán)35次；72 ℃再延伸10 min。隨后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。隨后將DNA送至上海美吉使用Illumina HiSeq平臺(tái)（中國上海美吉生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.4 理化指標(biāo)的測(cè)定

水分測(cè)定采用烘干法，采用酸堿滴定法測(cè)定酸度，采用斐林試劑法測(cè)定淀粉、還原糖。具體參照文獻(xiàn)[12]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

基于Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)中的R語言繪制群落組成圖、Heatmap圖、冗余分析圖，柱狀圖利用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬香型白酒不同輪次酒醅理化指標(biāo)分析結(jié)果

醬香型白酒的理化指標(biāo)是鑒定不同輪次酒醅是否發(fā)酵成熟的標(biāo)準(zhǔn)，反映著醬酒的品質(zhì)高低，而理化指標(biāo)是主要受生產(chǎn)工藝和發(fā)酵時(shí)間的影響，不同輪次的工藝參數(shù)不一致，因此對(duì)不同輪次的堆積酒醅理化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，深入解析理化指標(biāo)引起的群落多樣性的變化，結(jié)果見圖2。

圖2 酒醅樣品理化指標(biāo)的變化Fig. 2 Change of physicochemical indexes of Jiupei samples

如圖2A所示，糟醅水分含量隨著輪次的增加顯著地增加（P＜0.05），在第6輪次時(shí)達(dá)到最大值，而后保持平衡。酸度主要是產(chǎn)酸菌進(jìn)行有機(jī)酸的代謝、生成其他酸性物質(zhì)進(jìn)而營造酸性環(huán)境。其在防止雜菌污染的同時(shí)，可將有機(jī)酸類物質(zhì)作為主要風(fēng)味物質(zhì)，且為酯類物質(zhì)的生成提供豐富的前體[13]。張健等[14]發(fā)現(xiàn)，總酸與白酒香氣強(qiáng)度和協(xié)調(diào)性呈強(qiáng)正相關(guān)。如圖2B所示，與水分含量相似，醬香型白酒堆積發(fā)酵過程中酸度先增加后降低，在第5輪次達(dá)到最高值，第6輪次顯著降低而后保持穩(wěn)定。還原糖經(jīng)淀粉酶、糖化酶等分解淀粉而生成，是微生物發(fā)酵的主要能量來源，醬香型白酒釀造是邊糖化邊發(fā)酵的過程，酒醅中還原糖的含量在一定程度上可以反應(yīng)酒醅發(fā)酵速度以及發(fā)酵情況，是衡量發(fā)酵質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。如圖2C所示，2～5輪次酒醅的還原糖含量較高，且彼此沒有顯著性差異（P＞0.05），而3、4輪次與1、6、7輪次存在顯著性差異，這也與實(shí)際生產(chǎn)中的發(fā)酵質(zhì)量相吻合。淀粉是酒精及其他代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)，酒醅的淀粉含量能有效反映出原料中淀粉是否利用充分及酒醅是否需要繼續(xù)發(fā)酵，如圖2D所示，隨著輪次的增加，淀粉含量顯著降低（P＜0.05），這是因?yàn)殡S著發(fā)酵輪次的增加，淀粉不斷的被分解成小分子物質(zhì)供微生物利用，這也與生產(chǎn)實(shí)踐相吻合。

2.2 真菌群落組成分析

2.2.1 在門水平上的分布

基于Illumina Miseq測(cè)序在機(jī)械化釀造7個(gè)輪次酒醅中共檢出真菌4個(gè)門，102個(gè)屬，185個(gè)OTU，酒醅樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上的分布結(jié)果見圖3。

圖3 酒醅樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上的分布Fig. 3 Fungal community structure of Jiupei samples at phylum level

如圖3所示，子囊菌門（Ascomycota）在不同輪次酒醅堆積發(fā)酵過程中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位（相對(duì)豐度占96.57%～99.99%），且隨著輪次的增加而減少。此外，研究表明Ascomycota是醬香型[15]、清香型[16]、濃香型[17]釀造酒醅的主要真菌，說明該菌門是中國白酒發(fā)酵過程中的關(guān)鍵真菌微生物種群。擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在前三輪次酒醅基本未檢出，從第四輪次開始含量增加。

2.2.2 在屬水平上的分布

酒醅樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的分布見圖4。由圖4可知，從機(jī)械化釀造1～7輪次堆積發(fā)酵過程共檢出真菌102個(gè)真菌屬，而成品曲中檢出60個(gè)真菌屬[18]，說明在堆積發(fā)酵過程富集了42個(gè)真菌屬。

圖4 酒醅樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的分布Fig. 4 Fungal community structure of Jiupei samples at genus level

1～7輪次酒醅中分別檢出23、34、62、35、40、35和50個(gè)屬，說明7個(gè)輪次堆積發(fā)酵酒醅樣本中的主要真菌群落組成存在較大的差異。其中，一輪次堆積發(fā)酵酒醅中的優(yōu)勢(shì)真菌屬（＞1%）有2個(gè)，分別為有孢圓酵母屬（Torulaspora）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）；二輪次有6個(gè)，包括嗜熱真菌屬（Thermomyces）、假絲酵母屬（Candida）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）等，三輪次有8個(gè)，包括有孢圓酵母屬（Torulaspora）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）等；四輪次有9個(gè)，包含嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）等；五輪次有9個(gè)，為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）等；六輪次有10個(gè)，分別為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）等；七輪次有8個(gè)，包括絲衣霉屬（Byssochlamys）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）等。

各個(gè)輪次堆積酒醅中沒有共有的優(yōu)勢(shì)菌屬，但嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、假絲酵母屬（Candida）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）的相對(duì)豐度較高（＞10%）。且嗜熱真菌屬（Thermomyces）是醬香型白酒大曲[19]中的優(yōu)勢(shì)真菌，是白酒釀造過程中重要酶類的來源，可促進(jìn)微生物的生長繁殖以及產(chǎn)酒生香[4]。嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）能夠產(chǎn)生熱穩(wěn)定的水解酶，降解原料中的淀粉或纖維素，是白酒釀造過程不可或缺的重要菌屬[20]。曲霉屬（Aspergillus）為醬香型白酒酒醅、醬香大曲[21]的優(yōu)勢(shì)菌屬，能產(chǎn)生多種酶類，可調(diào)控大曲和酒醅的糖化力、酯化力、液化力，是公認(rèn)的功能菌。同時(shí)其可通過代謝有機(jī)酸、脂肪酸，促成芳香酯類物質(zhì)的生成，以提升和改善酒體風(fēng)味[22]。孢圓酵母屬（Torulaspora）能產(chǎn)生大量的高級(jí)醇、酯類物質(zhì)、酸類物質(zhì)等，可明顯提高酒中乙基酯類的含量，增加酒體的果香味[23]，其在醬香型白酒[24]中均檢測(cè)出。絲衣霉屬（Byssochlamys）隨著發(fā)酵輪次的進(jìn)行逐漸增多（0.34%～69.03%），產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是發(fā)酵酒醅的酸度變化為該菌的生長提供了適宜的條件[25]。Byssochlamys能產(chǎn)生耐熱的子囊孢子[26]，該菌屬在醬香型白酒釀造酒醅中[10]和大曲中均可檢出[27]。假絲酵母屬（Candida）在機(jī)械化釀造堆積的二輪次中豐度較高，在第五輪次中則幾乎未檢測(cè)出，溫度的變化是導(dǎo)致該現(xiàn)象的主要原因[28]，Candida是醬香型白酒堆積和窖池發(fā)酵酒醅優(yōu)勢(shì)真菌屬[10]，對(duì)提升酒體品質(zhì)具有重要作用。威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）只在一輪次的堆積酒醅中豐度較高，是重要的生香酵母屬，耐高酸度[29]且產(chǎn)酯能力強(qiáng)[30]，主要來源于大曲的添加。綜合其豐度和功能，上述真菌屬被認(rèn)為是醬香型白酒機(jī)械化堆積過程中的重要真菌屬，說明在醬香型白酒堆積發(fā)酵過程存在穩(wěn)定的微生物結(jié)構(gòu)演替，從而為酒醅的發(fā)酵提供內(nèi)在的動(dòng)力。

由于各輪次發(fā)酵酒醅的不斷蒸煮糊化以及發(fā)酵環(huán)境的改變，使得7個(gè)輪次酒醅中的微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異。其中一、二輪次堆積酒醅樣品中的真菌種類相對(duì)較少，而從三輪次開始，真菌群落逐漸增多；另外，1～3個(gè)輪次堆積酒醅中的真菌主要以酵母菌為主，4～7輪次中則以霉菌為主，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是酒醅經(jīng)過機(jī)械化的輸送和堆積，在很大程度上會(huì)增大其水分含量和糟醅黏性，使得發(fā)酵后期的酵母生長受到抑制。七個(gè)輪次機(jī)械化堆積的發(fā)酵時(shí)間以及發(fā)酵環(huán)境不同，導(dǎo)致其微生物結(jié)構(gòu)組成不同，這也是形成不同酒體風(fēng)格的重要原因之一。

2.3 環(huán)境因子對(duì)酒醅真菌群落組成結(jié)構(gòu)的影響

微生物的生命活動(dòng)離不開環(huán)境因子的調(diào)控，因而環(huán)境因子對(duì)于醬香型白酒機(jī)械化釀造過程中的真菌菌群結(jié)構(gòu)組成有著密切的關(guān)系，環(huán)境因子對(duì)酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)的影響見圖5。

圖5 環(huán)境因子對(duì)酒醅樣品真菌群落結(jié)構(gòu)的影響Fig. 5 Effects of environmental factors on fungal communities of Jiupei samples

由圖5可知，水分、酸度、還原糖、淀粉含量對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有著重要的影響，其中淀粉含量與酸度和水分負(fù)相關(guān)（環(huán)境因子箭頭間的夾角為鈍角），淀粉和還原糖之間以及還原糖與水分之間關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)（環(huán)境因子箭頭間的夾角接近直角），而水分和酸度含量、還原糖和酸度呈現(xiàn)正相關(guān)（環(huán)境因子箭頭間的夾角為銳角），且微生物受淀粉含量、水分和酸度的影響較大（投影點(diǎn)距離原點(diǎn)的距離較遠(yuǎn)）。其中，不同輪次的真菌菌群結(jié)構(gòu)受淀粉含量影響較大，隨著輪次的增加，與淀粉含量的相關(guān)性從正相關(guān)走向負(fù)相關(guān)，這主要是因?yàn)樯弦还?jié)中說明在不同輪次中存在穩(wěn)定的霉菌結(jié)構(gòu)，其可直接利用淀粉，分解淀粉為小分子物質(zhì)為其他微生物提供養(yǎng)料，隨著發(fā)酵輪次的增加，酒醅中的淀粉已經(jīng)消耗殆盡，發(fā)酵進(jìn)入尾聲，沒有更多的發(fā)酵底物供給微生物生長。1～3輪次酒醅發(fā)酵的微生物結(jié)構(gòu)與水分負(fù)相關(guān)，而4～7輪次酒醅與水分正相關(guān)。這是因?yàn)椴煌喆尉契l(fā)酵過程的環(huán)境溫度在逐步增加，且隨著輪次的增加，酒醅不斷的蒸煮，其保水能力變?nèi)酢?～3輪次酒醅發(fā)酵過程微生物菌群結(jié)構(gòu)與酸度呈負(fù)相關(guān)，而4～7輪次酒醅與酸度呈正相關(guān)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，產(chǎn)酸微生物代謝酸類化合物使得酸度不斷的增加。一輪次和七輪次酒醅的微生菌群結(jié)構(gòu)與還原糖含量呈負(fù)相關(guān)，其他輪次對(duì)于微生物的結(jié)構(gòu)的影響較小。生產(chǎn)實(shí)踐表明，一輪次和七輪次的酒質(zhì)不好這也許與還原糖的含量有關(guān)。

2.4 環(huán)境因子與微生物關(guān)聯(lián)性分析

為進(jìn)一步探究環(huán)境因子對(duì)哪些菌屬的影響較大，進(jìn)而方便控制參數(shù)來保證發(fā)酵的正常運(yùn)行。將微生物菌屬與環(huán)境因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，真菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性熱圖見圖6。

由圖6可知，大部分菌屬與水分、酸度及還原糖呈正相關(guān)，而與淀粉含量呈負(fù)相關(guān)。其中，紅曲霉屬（Monascus）、Rasamsonia、Trichosporon、Penicillium、Microascus與水分和酸度呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與淀粉含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。紅曲霉屬（Monascus）是醬香型白酒釀造中主要霉菌，具有一定的糖化發(fā)酵力和較強(qiáng)的酯化力，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種酶類，如蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等，對(duì)提高出酒率、增加酯類化合物的生成具有積極影響。同時(shí)，還可產(chǎn)生多種對(duì)人體有益的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如紅曲色素、γ-氨基丁酸等[31]。Rasamsonia在醬香型白酒大曲中檢出，該菌屬能耐高溫，有利于淀粉的分解[32]。Trichosporon是醬香型白酒釀造過程中公認(rèn)的產(chǎn)多元醇的功能酵母[33]，Penicillium在醬香型白酒在傳統(tǒng)釀造過程中均能檢測(cè)到，其產(chǎn)生的酶種類較豐富且齊全，主要是蛋白酶、纖維素酶、酯化酶，此外還其代謝物大多具有抑菌作用[34]。Microascus在醬香型白酒大曲中檢出[35]。而豐度較大的菌屬，如Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus、Candida和Wickerhamomyces，其受環(huán)境因子的影響較小。而Torulaspora與酸度呈負(fù)相關(guān)，Byssochlamys與淀粉呈負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果表明，在機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵過程中，重要真菌屬和優(yōu)勢(shì)菌屬受環(huán)境因子的調(diào)控不大，從而保證發(fā)酵的底物充足，而不同輪次又存在著與水分、淀粉含量和酸度緊密相關(guān)的菌屬，其隨著環(huán)境的變化而變化，從而動(dòng)態(tài)的調(diào)控著釀造發(fā)酵的正常進(jìn)行。

圖6 真菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性熱圖Fig. 6 Heatmap of correlation between fungal communities and environmental factors

3結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序及數(shù)理分析方法系統(tǒng)性的研究醬香型白酒機(jī)械化釀造不同輪次堆積發(fā)酵酒醅中的真菌菌群結(jié)構(gòu)特征，七個(gè)輪次酒醅中共檢出真菌4個(gè)門，102個(gè)屬，185個(gè)OTU。Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus、Torulaspora、Byssochlamys、Candida和Wickerhamomyces被認(rèn)為是醬香型白酒機(jī)械化堆積過程中的重要真菌屬。醬香型白酒機(jī)械化釀造過程中的真菌微生物受淀粉含量、水分和酸度的影響較大。其中隨著輪次的增加，真菌的菌群結(jié)構(gòu)與淀粉含量的相關(guān)性從正相關(guān)變?yōu)樨?fù)相關(guān)，1～3輪次發(fā)酵酒醅的微生物結(jié)構(gòu)與水分和酸度負(fù)相關(guān)，而4～7輪次發(fā)酵酒醅與水分和酸度正相關(guān)。一輪次和七輪次酒醅的微生菌群結(jié)構(gòu)與還原糖含量呈負(fù)相關(guān)，其他輪次對(duì)于微生物的結(jié)構(gòu)的影響較小。在機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵過程中，重要的菌屬受環(huán)境因子的調(diào)控不大，但不同輪次存在著與水分、淀粉含量和酸度緊密相關(guān)的菌屬，保證動(dòng)態(tài)的調(diào)控釀造發(fā)酵過程。本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)解析了機(jī)械化釀造堆積酒醅中的主要真菌群落結(jié)構(gòu)變化，揭示了機(jī)械化堆積在真菌群落結(jié)構(gòu)組成，為全面實(shí)現(xiàn)醬香型白酒機(jī)械化釀造提供了理論依據(jù)。