劉亞超，陳小雪，程 偉，周 艷，韓北忠，李永玉*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.四川郎酒集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川 瀘州 510500）

高粱作為醬香型白酒生產(chǎn)的重要原料，其品質(zhì)的優(yōu)劣在釀酒過程中起著決定性的作用，并直接影響成品酒的質(zhì)量[1-7]。多數(shù)酒企為了保證白酒發(fā)酵品質(zhì)，除了特有的釀造工藝和流程，同時(shí)還需要符合企業(yè)特需的高粱作原料。然而一些中間商為了獲取更多利益，將其他品種的高粱混入特需高粱售于酒企，這會(huì)對(duì)酒品質(zhì)造成一定的隱患，因此對(duì)特需高粱的真實(shí)性把控顯得尤為重要。目前主要通過感官評(píng)價(jià)（外觀色澤、蒸煮等）來檢測高粱是否為所需品種，也有使用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）鑒別需求高粱的真實(shí)性[8]。雖然這些方法成熟，但是需要有大量經(jīng)驗(yàn)的人進(jìn)行操作，不宜大范圍推廣。同時(shí)這些方法存在主觀性、檢測速度較慢等問題。因此，如何能夠快速、有效的檢驗(yàn)特需高粱的真實(shí)性是目前酒企急需解決的問題。

近紅外光譜是一種快速、有效、綠色的分析方法，主要反映的是物質(zhì)成分中含氫基團(tuán)在近紅外區(qū)域的特性[9]。近紅外光譜是一種綜合信息，包括物質(zhì)內(nèi)部成分和外部信息，其在各領(lǐng)域中的定量或定性分析方面已取得豐富的成果[10-15]。在高粱檢測方面，近紅外光譜分析主要用于高粱內(nèi)部成分的定量分析[1，16-19]，通常需要將高粱進(jìn)行粉碎進(jìn)行測定?；诮t外光譜的特需高粱無損鑒別而言，獲取樣品池內(nèi)特需高粱和摻假高粱在內(nèi)的所有樣品的完整信息是保證判別結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)。然而，高粱顆粒透光性較差，加上檢測器探頭有效探測面積有限，難以獲取特需高粱和摻假高粱顆粒全部的樣品信息。

本實(shí)驗(yàn)以實(shí)現(xiàn)特需高粱真實(shí)性的快速無損鑒別為目的，針對(duì)高粱透光性差，近紅外探頭有效探測面積有限，難以有效獲取樣品池中特需高粱和摻假高粱的整體樣品信息等問題，改良樣品杯直徑和檢測窗口直徑的匹配關(guān)系，優(yōu)化樣品在樣品杯的填充方式，解決無法采集樣品池中整體樣品信息等問題，有效獲取包括摻假高粱顆粒的整體樣品信息，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法優(yōu)化模型建立，最終實(shí)現(xiàn)特需高粱真實(shí)性快速無損實(shí)時(shí)鑒別，為今后開發(fā)便攜式特需高粱真實(shí)性鑒別設(shè)備提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 高粱樣品

特需高粱、紅茂粱、金糯粱：由四川郎酒集團(tuán)有限責(zé)任公司品質(zhì)研究院提供；三種高粱大小較為相似，其中金糯粱與特需高粱無法通過外觀直接區(qū)分，紅茂粱相比特需高粱顏色偏黃。

1.2 儀器與設(shè)備

Antaris II傅里葉變換近紅外光譜儀（有效探測范圍為4 000～10 000 cm-1（1 000～2 500 nm），分辨率為4 cm-1）：美國賽默飛公司。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的成果，定制一款符合本研究的環(huán)形樣品杯，其內(nèi)徑略大于檢測窗口直徑的2倍，通過上下移動(dòng)載臺(tái)，即保證檢測器可以有效獲取樣品信息，又保證了樣品量。并且，樣品杯還備有上蓋，保證光譜采集過程中不受外界光干擾。

1.3 樣品制備及填充

1.3.1 方法

由于高粱樣品的透光性較差，為了保證采集樣品信息的有效性，基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)樣品填充方式及樣品盤直徑進(jìn)行了優(yōu)化。將樣品平鋪于樣品杯底部，層數(shù)為一層，保證檢測器可以采集樣品的全部信息。

根據(jù)實(shí)際高粱混合情況，分別將金糯粱和紅茂粱與特需高粱按照不同混合比例一對(duì)一混合制備樣品（見表1）。摻入樣品的量由每次填充樣品杯的顆粒數(shù)量乘以混合比例決定，需求樣品和混合樣品總共制備210個(gè)樣。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案的可行性，從210個(gè)樣品隨機(jī)抽取30個(gè)樣品作為獨(dú)立驗(yàn)證集，剩余樣品為訓(xùn)練集用于建立高粱近紅外判別模型。

表1 需求樣品和混合樣品混合比例Table 1 Mixing ratio of demend sample and mixed sample

1.3.2 數(shù)據(jù)分析及模型評(píng)價(jià)

在采集樣品光譜數(shù)據(jù)時(shí)，由于受儀器穩(wěn)定性、環(huán)境等因素的影響，光譜數(shù)據(jù)除了包含樣品的有效信息也包括一些噪聲，因此需要對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理以獲取更有效的信息。在本文中使用多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC），標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換結(jié)合去趨勢（standard normal variate transformation+D，SNV+D），一階卷積求導(dǎo)（1st Der.（S-G））和二階卷積求導(dǎo)（2nd Der.（S-G））等算法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理[20-21]。預(yù)處理后的數(shù)據(jù)結(jié)合偏最小二乘判別算法（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）建立高粱近紅外判別模型[22-23]。模型的性能由最終判別結(jié)果的準(zhǔn)確率決定，準(zhǔn)確率越高，模型性能越好，判別準(zhǔn)確率可由以下公式計(jì)算：

式中：A代表判別結(jié)果的準(zhǔn)確率，N代表樣品總數(shù)量，Nright代表判別正確的樣品數(shù)量，Nwrong代表判別錯(cuò)誤的樣品數(shù)量，以上計(jì)算均在Matlab（R2014a）中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱近紅外光譜分析

所有高粱樣品的近紅外光譜見圖1。由圖1可知，在1000～2 500 nm波長范圍內(nèi)存在6個(gè)吸收峰。根據(jù)已有研究[24-25]，其中波長1 206 nm附近的吸收峰與-CH3中的C-H鍵對(duì)稱拉伸的二級(jí)倍頻有關(guān)，波長1 463 nm附近吸收峰與淀粉O-H鍵反對(duì)稱和對(duì)稱拉伸有關(guān)，在波長1 933 nm附近的吸收峰與淀粉的O-H鍵拉伸和彎曲結(jié)合有關(guān)，波長2 127 nm附近的吸收峰為N-H伸縮振動(dòng)與酰胺Ⅲ的組合頻有關(guān)。波長2 313 nm和2 353 nm處存在弱的吸收峰，均與-CH2中C-H鍵的伸縮和彎曲振動(dòng)有關(guān)。由此可見，高粱在1 000～2 500 nm之間的近紅外光譜信號(hào)主要由淀粉、蛋白質(zhì)及其他碳水化合物的近紅外信號(hào)組成。除此之外，需求高粱的光譜與混合高粱的光譜沒有明顯的差異，并且混合高粱的光譜將需求高粱的光譜完全覆蓋。

圖1 高粱樣品近紅外光譜圖Fig. 1 Near infrared spectroscopy of sorghum samples

2.2 高粱判別模型建立

為減少高粱光譜數(shù)據(jù)中非目標(biāo)信息的干擾，提高光譜特征信號(hào)的分辨率，對(duì)原始光譜進(jìn)行了不同數(shù)據(jù)預(yù)處理，消除其他因素對(duì)圖譜信息的影響，預(yù)處理結(jié)果如圖2所示。其中MSC預(yù)處理消除光散射對(duì)光譜的數(shù)據(jù)的影響；S-G預(yù)處理通過平滑消除光譜數(shù)據(jù)的噪聲；SNV+D主要用于消除顆粒大小，表面散射，基線漂移對(duì)光譜的影響；1st Der.（S-G）可以消除基線及其他背景的干擾，分辨重疊峰，提高分辨率；2nd Der.（S-G）在1st Der.（S-G）的基礎(chǔ)進(jìn)行二次求導(dǎo)。需要注意的是，在使用一階卷積求導(dǎo)和二階卷積求導(dǎo)預(yù)處理時(shí)雖然消除了基線和背景的干擾，但同時(shí)也會(huì)放大某些噪聲，這些噪聲對(duì)模型產(chǎn)生何種影響還需要通過最終的模型結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。

圖2 不同預(yù)處理方法的高粱樣品近紅外光譜Fig. 2 Near infrared spectroscopy of sorghum samples with different pretreatment methods

在建立模型前，先將訓(xùn)練集數(shù)據(jù)按照3∶1分為校正集和預(yù)測集，使用不同預(yù)處理數(shù)據(jù)結(jié)合PLS-DA建立的高粱鑒別模型結(jié)果如表2所示。

表2 不同預(yù)處理方法的高粱樣品鑒別近紅外光譜模型結(jié)果Table 2 Near infrared spectroscopy model results for identification of sorghum samples with different pretreatment methods

從表2可以看出，使用原始光譜和經(jīng)S-G預(yù)處理后的光譜分別建立的高粱近紅外判別模型性能較好，校正集和預(yù)測集的判別結(jié)果均為100%，使用其他預(yù)處理方法建立模型的判別準(zhǔn)確率略低于前者。使用其他預(yù)處理建立模型的校正集判別結(jié)果準(zhǔn)確率均在99.3%，然而使用1st Der.（S-G）和2nd Der.（S-G）預(yù)處理建立的模型預(yù)測集判別結(jié)果較差，分別為95.6%和93.3%。正如前面所述，使用導(dǎo)數(shù)預(yù)處理雖然可以提高光譜分辨率和消除基線漂移，但是在預(yù)處理過程也放大了某些噪聲，表2中的結(jié)果證明了這些噪聲對(duì)模型的性能產(chǎn)生負(fù)面影響。

基于表2的結(jié)果，本研究提出的實(shí)驗(yàn)方案是可行，其中使用原始光譜和S-G預(yù)處理后的光譜建立的模型判別結(jié)果均為100%。

2.3 高粱判別模型驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可行性，將隨機(jī)抽取的30個(gè)樣品用于外部獨(dú)立驗(yàn)證，對(duì)光譜數(shù)據(jù)按照相同的流程進(jìn)行預(yù)處理并導(dǎo)入對(duì)應(yīng)的模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表3所示。

表3 不同預(yù)處理方法的高粱樣品鑒別近紅外光譜模型驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Near infrared spectroscopy model validation results for identification of sorghum samples with different pretreatment methods

從表3可以看出，其中原始數(shù)據(jù)、MSC預(yù)處理、S-G預(yù)處理的驗(yàn)證集判別準(zhǔn)確率均為96.7%，其判錯(cuò)的樣品混合比例為10%（特需高粱-紅茂粱），其余預(yù)處理的驗(yàn)證集判別結(jié)果準(zhǔn)確率均高于90%，這再次表明本文提出的實(shí)驗(yàn)方案是具有可行的，可以用于鑒別需求高粱的真實(shí)性。需要注意的是，經(jīng)SNV+D預(yù)處理的驗(yàn)證集判錯(cuò)兩個(gè)真實(shí)樣品和一個(gè)混合樣品，結(jié)合表2結(jié)果，表明該預(yù)處理方法不適用于高粱鑒別判別。

2.4 結(jié)果分析

基于表2和表3的結(jié)果，使用原始數(shù)據(jù)和S-G預(yù)處理建立的模型性能最好，兩者的判別結(jié)果見圖3。由圖3可知，兩者的判別結(jié)果相同，校正集、預(yù)測集和驗(yàn)證集的判別準(zhǔn)確率分別為100%、100%和96.7%。

從圖3可以發(fā)現(xiàn)，使用原始數(shù)據(jù)和S-G預(yù)處理數(shù)據(jù)分別建立的模型結(jié)果非常相似，這主要是因?yàn)镾-G處理只是對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑，并沒有明顯改變光譜特征（圖2）。雖然結(jié)果相似，但實(shí)際預(yù)測的結(jié)果還是存在微小差異，如圖3C和圖3F中同一樣品的預(yù)測結(jié)果分別為0.522 7和0.524 7。使用其他預(yù)處理的校正集結(jié)果雖然與圖3中的結(jié)果相差不大，但預(yù)測集和驗(yàn)證集的判別結(jié)果卻不如圖3中對(duì)應(yīng)集合的判別結(jié)果。這主要是因?yàn)轭A(yù)處理雖然可以消除大量的噪聲，改善光譜的分辨率，但是不恰當(dāng)?shù)念A(yù)處理反而會(huì)降低模型的性能，如1st Der.（S-G）和2nd Der.（S-G）（表3）。

圖3 高粱樣品鑒別近紅外光譜模型校正集、預(yù)測集、驗(yàn)證集判別結(jié)果Fig. 3 Discrimination results of NIR model calibration set, prediction set, validation set for sorghum samples identification

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將近紅外光譜分析技術(shù)首次用于特需釀酒高粱真實(shí)性鑒別，彌補(bǔ)了該方面研究的空白。通過優(yōu)化樣品填充方式，改良樣品杯與檢測窗口的匹配度，確保了檢測器可以采集更多的樣品有效信息，從而解決了近紅外光譜技術(shù)在鑒別特需高粱方面存在的問題。在樣品光譜采集后，將光譜數(shù)據(jù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合建立高粱近紅外鑒別模型，其結(jié)果表明使用原始數(shù)據(jù)和S-G預(yù)處理建立的模型性能最好，且兩者的判別結(jié)果相同，校正集、預(yù)測集和驗(yàn)證集的判別準(zhǔn)確率分別為100%、100%和96.7%?；趯?shí)驗(yàn)結(jié)果，表明了近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)可以實(shí)現(xiàn)快速、無損的鑒別高粱的真實(shí)性。同時(shí)，也為今后開發(fā)便攜式特需釀酒高粱真實(shí)性鑒別儀提供了數(shù)據(jù)參考。