程水明，潘惠雯，韓寒冰

（廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000）

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）為薔薇科山楂屬落葉灌木果實，是最早被列為食藥兼用的水果之一。山楂在我國分布廣泛，產(chǎn)量豐富，主要分布在中國中部與南部地區(qū)，是重要經(jīng)濟作物[1]。山楂主要活性成分為黃酮、異黃酮類和有機酸類（山楂酸、酒石酸、檸檬酸等）[2]。山楂中黃酮類化合物的提取、活性評價（防心血管病、降血脂、消炎抗菌及抗腫瘤等）與發(fā)掘已成研究熱點[3-7]。目前有關(guān)山楂果實、葉、核（籽）中黃酮類化合物的提取與分離純化已有較多報道[8-11]，大部分是通過物理或化學(xué)手段從植物中直接提取，但該方法存在提取工藝復(fù)雜、產(chǎn)率低、大規(guī)模制備受限等問題。如何提高植物中黃酮的利用率，一直是科學(xué)家們探索的一個熱點。黃酮類化合物的生物合成途徑較短，在微生物中合成有很大優(yōu)勢，近年來，隨代謝工程以及合成生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，以生長快速、遺傳背景簡單、易于操作的模式微生物作為細(xì)胞工廠合成天然活性產(chǎn)物（如黃酮類化合物）成為研究熱點[12]。

利用微生物發(fā)酵中藥在千余年前就有應(yīng)用，如淡豆豉、六神曲、豆黃等[13]?，F(xiàn)代發(fā)酵中藥研究始于20世紀(jì)80年代，主要集中在一些真菌的純種發(fā)酵，如冬蟲夏草、槐耳、靈芝等[13]，而利用食用真菌發(fā)酵山楂則鮮有報道；目前已發(fā)表的關(guān)于山楂總黃酮含量的測定方法主要為高效液相色譜法和可見分光光度法[17]。與高效液相色譜法相比，可見分光光度法具有適用性較廣、操作簡單、測試時間短、精密度高和準(zhǔn)確度好等特點，基于此，本研究利用初篩出的20種食用真菌來發(fā)酵山楂，采用可見分光光度法測定總黃酮含量，以期篩選出適于發(fā)酵山楂的食用真菌，并優(yōu)化其發(fā)酵工藝，為黃酮類化合物資源開發(fā)及山楂資源深度利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：2020年10月采摘于廣東信宜成熟的大果山楂鮮果。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量＞98%）：南京都萊生物技術(shù)有限公司；硝酸鋁（分析純）：上海阿拉丁有限公司；乙醇（分析純）：西隴科學(xué)有限公司；硫酸鎂（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：羅恩試劑有限公司；試驗用水為實驗室自制超純水。

20種食用真菌（桑黃（Fleckedflesh polypore）、長根菇（Pleurotus nebrodensis）、黑平菇（Pleurotus ostreatus）、繡球菌（Sparassis crispa）、蛹蟲草（Cordyceps militaris）、灰褐香蘑（Lepista panaeola）、茯苓（Wolfiporia cocos）、玉覃離褶傘（Lyophyllum shimeji）、金針菇（Flammulina velutipes）、香菇（Lentinula edodes）、野蘑菇（Agaricus arvensis）、白小圈齒麟傘（Pholiota albocrenulata）、毛栓菌（Trametes hirsuta）、裂褶菌（Schizophyllum commune）、滑菇（Pleurotus ostreatus）、毛柄庫恩菇（Kuehneromyces mutabilis）、黃傘（Pholiota adiposa）、蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、阿魏菇（Pleurotus ferulae））：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏中心。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯汁20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；DF-15高速萬能粉碎機：浙江溫嶺市林大機械有限公司；DHG-9073BS-Ⅲ電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械有限公司；CR-080S超聲波清洗器：深圳市春霖清洗設(shè)備有限公司；V-5000型722分光光度計：上海元析儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SPX-250B人工智能生化培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；L5S紫外可見分光光度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TG16A-WS臺式高速微量離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；NRY-1102立式恒溫?fù)u床：上海南榮實驗室設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液制備

將供試食用真菌接種于液體培養(yǎng)基，25 ℃、100 r/min搖床培養(yǎng)3 d得種子液；將山楂除雜，于50 ℃條件下烘干，粉碎過100目篩，以4%添加量加入液體培養(yǎng)基中，滅菌后按接種量5%（V/V）接入培養(yǎng)基，得山楂發(fā)酵液。

1.3.2 食用真菌發(fā)酵山楂工藝優(yōu)化

菌株選?。喊凑?.3.1進(jìn)行山楂發(fā)酵液制備，以總黃酮含量為考察指標(biāo)，選取發(fā)酵液中總黃酮含量最高的食用真菌作為后續(xù)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化用菌株。

單因素試驗：在培養(yǎng)基和其他條件不變情況下分別考察發(fā)酵溫度（20.0 ℃、22.5 ℃、25.0 ℃、27.5 ℃、30.0 ℃、32.5 ℃）；發(fā)酵時間（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d）；料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g∶mL））；接種量（1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%、9.0%）對發(fā)酵液總黃酮含量的影響。

響應(yīng)面試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）和料液比（D）4個因素作為自變量，以發(fā)酵液總黃酮含量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 食用真菌發(fā)酵山楂工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for hawthorn fermentation process optimization by edible fungi

1.3.3 總黃酮含量測定[18]

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取5.00 mg蘆丁對照品，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇定容至25 mL，得0.20 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。依次取0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入0.3 mL 5%NaNO2靜置5 min，加0.3 mL 10%Al（NO3）3靜置6 min，2 mL 4%NaOH，體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容至10 mL，放置15 min后于波長510 nm處測吸光度值；以蘆丁含量（x）為橫坐標(biāo)，OD510nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程，確定相關(guān)系數(shù)。

1.3.4 試驗數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行收集整理；用Origin 9.0對菌種篩選、單因素試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖；用Design Expert 12.0中的Box-Behnken進(jìn)行方差和響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用真菌發(fā)酵菌種篩選結(jié)果分析

20種食用真菌在相同條件下與山楂液體培養(yǎng)基進(jìn)行共發(fā)酵，以總黃酮含量為考察指標(biāo)，篩選轉(zhuǎn)化效率最高的食用真菌，結(jié)果見圖1。

圖1 20種食用真菌發(fā)酵山楂總黃酮含量比較Fig. 1 Comparison of total flavonoids contents of fermented hawthorn by 20 edible fungi

由圖1可知，山楂經(jīng)食用真菌發(fā)酵后總黃酮含量均比未經(jīng)發(fā)酵時有所增加，表明經(jīng)食用真菌發(fā)酵可有效促進(jìn)山楂中總黃酮類化合物的形成和釋放。其中經(jīng)蛹蟲草發(fā)酵后的發(fā)酵液中總黃酮含量最高，為33.8 mg/g，是空白對照（19.2 mg/g）的176%。因此后續(xù)試驗中選用蛹蟲草作為試驗用菌種。

2.2 蛹蟲草發(fā)酵山楂單因素試驗結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度對山楂基發(fā)酵液總黃酮含量的影響

由圖2可知，發(fā)酵溫度為20.0～22.5 ℃時，山楂基發(fā)酵液中總黃酮含量緩慢增加，25 ℃時達(dá)最高值36.0 mg/g，隨后趨于穩(wěn)定。原因是溫度低時酶活性低，真菌生長及代謝慢；隨溫度升高，微生物生化反應(yīng)速率和生長速率加快，對基質(zhì)的吸收和分解增加；因黃酮不耐高溫，高溫會引起分解或結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致總黃酮含量略有降低。因此選擇最佳發(fā)酵溫度為25 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對山楂基發(fā)酵液中總黃酮含量的影響Fig. 2 Effect of fermentation temperature on total flavonoids contents in hawthorn fermentation broth

2.2.2 發(fā)酵時間對山楂基發(fā)酵液總黃酮含量的影響

由圖3可知，隨發(fā)酵時間延長，總黃酮含量逐步增加，發(fā)酵第7天時達(dá)最高值35.2 mg/g，隨后略有下降但總體趨于穩(wěn)定。可能是因為3～5 d內(nèi)真菌群體數(shù)量少，生長緩慢且以菌體生長為主，代謝產(chǎn)物積累少，轉(zhuǎn)化的總黃酮量也相對較少；5～7 d內(nèi)真菌生長進(jìn)入快速生長期，代謝旺盛，轉(zhuǎn)化山楂中總黃酮速度加快，總黃酮含量增長快，7 d后達(dá)峰值。因此選擇最佳發(fā)酵時間為7 d。

圖3 發(fā)酵時間對山楂基發(fā)酵液中總黃酮含量的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on total flavonoids contents in hawthorn fermentation broth

2.2.3 料液比對山楂基發(fā)酵液總黃酮含量的影響

由圖4可知，隨著料液比的變化，山楂基發(fā)酵液中總黃酮含量不斷增加，在料液比為1∶35（g∶mL）之前增長較快，隨后雖仍在上升但增加緩慢，這是因為隨發(fā)酵液體積增加，山楂粉與發(fā)酵液接觸面積增加，加快了黃酮類化合物溶出，但發(fā)酵液用量過大，后續(xù)步驟耗能亦會相應(yīng)增加。因此選擇最佳料液比為1∶35（g∶mL）。

圖4 料液比對山楂基發(fā)酵液中總黃酮含量的影響Fig. 4 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids contents in hawthorn fermentation broth

2.2.4 接種量對山楂基發(fā)酵液總黃酮含量的影響

由圖5可知，隨接種量在1.5%～6.0%范圍內(nèi)的增加，山楂基發(fā)酵液總黃酮含量呈增加趨勢，接種量為6.0%時達(dá)最高值39.6 mg/g，隨后趨于穩(wěn)定；接種量＞6.0%時，菌體群體過大，生長限制因子不足，導(dǎo)致真菌菌體自身衰老或發(fā)生自溶等，從而影響后續(xù)黃酮的分離。因此選擇最佳接種量為6.0%。

圖5 接種量對山楂基發(fā)酵液中總黃酮含量的影響Fig. 5 Effect of inoculum on total flavonoids contents in hawthorn fermentation broth

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草發(fā)酵山楂工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以總黃酮含量（Y）為響應(yīng)值，選取發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）和料液比（D）4個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 蛹蟲草發(fā)酵山楂工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for hawthorn fermentation process optimization by Cordyceps militaris

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of regression model

利用Design Expert 12.0對響應(yīng)面試驗結(jié)果（表2）進(jìn)行多元回歸擬合，得到發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、料液比對山楂發(fā)酵液總黃酮含量影響的二次多項式回歸模型：Y=2.60+0.066 7A+0.009 2B-0.133 3C+0.014 2D+0.020 0AB-0.075 0AC+0.005 0AD-0.002 5BC-0.030 0BD+0.017 5CD-0.416 8A2-0.253 1B2-0.441 8C2-0.050 6D2。

2.3.2 響應(yīng)面顯著性及方差分析

模型方差分析結(jié)果（表3）表明，回歸模型P＜0.000 1，極顯著，模型的實際值與預(yù)測值線性擬合決定系數(shù)為0.984，說明模型能解釋98.4%的響應(yīng)值變化，誤差小，模型F=61.44、調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.968，變異系數(shù)3.40%，表明試驗精確度良好，方程模型擬合度較好。一次項A、C，二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC，二次項D2對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），一次項B、D，交互項AB、AD、BC、BD、CD對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。4個因素對結(jié)果影響主次排序為C＞A＞D＞B，即接種量＞發(fā)酵時間＞料液比＞發(fā)酵溫度。

2.3.3 響應(yīng)曲面圖交互分析結(jié)果

響應(yīng)曲面圖中曲線走勢越陡，表明該因素影響越顯著；反之，走勢平滑則表明該因素影響較小[21-22]。等高線為橢圓形表明兩因素的交互作用顯著，圓形則代表交互作用不顯著。由圖6可知，發(fā)酵時間（A）與接種量（C）的等高線呈橢圓形，表明A與C交互作用明顯。在發(fā)酵時間6～8 d，總黃酮含量隨發(fā)酵時間增加呈先升后降趨勢，上升較快，下降緩慢；接種量對發(fā)酵液中總黃酮含量的影響同樣呈先增后減趨勢。但A因子的曲面傾斜度小于C因子，即曲面更加陡峭，說明發(fā)酵時間較接種量對總黃酮含量影響更大。與表3方差分析中AC交互項的P=0.014 4＜0.05，A與C交互作用顯著的結(jié)果相一致。

圖6 發(fā)酵時間與接種量交互作用對山楂發(fā)酵液中總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between fermentation time and inoculum on total flavonoids yields in hawthorn fermentation broth

2.3.4 驗證試驗結(jié)果

通過Design-Expert 12.0擬合得到山楂發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時間7.095 d、發(fā)酵溫度25.040 ℃、接種量5.77%和料液比1∶35.556（g∶mL），在此條件下總黃酮含量預(yù)測值為41.5 mg/g。為實際操作方便，修正工藝參數(shù)為發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度25 ℃、接種量6.0%和料液比1∶35（g∶mL），在此優(yōu)化條件下進(jìn)行5次驗證試驗，山楂發(fā)酵液中總黃酮含量平均值為42.8 mg/g，與預(yù)測值41.5 mg/g誤差很小，表明優(yōu)化發(fā)酵工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。

2.4 討論

微生物轉(zhuǎn)化是增加天然產(chǎn)物多效性有效方法之一，已廣泛應(yīng)用于食品、工業(yè)、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域[23]，但在山楂中應(yīng)用甚少，付莉莉等[24]采用5種食用真菌通過正交設(shè)計試驗與山楂共發(fā)酵，結(jié)果為冬蟲夏草發(fā)酵效果最好，結(jié)論為利用食用真菌發(fā)酵山楂總黃酮含量明顯高于傳統(tǒng)提取方法，且條件溫和可保留其有效成分不被高溫分解，但存在供試菌種少、代表性不全面，所采用的正交試驗方法無法在試驗范圍內(nèi)確定影響因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值等不足。為系統(tǒng)、全面探究食用真菌發(fā)酵山楂的發(fā)酵工藝，本研究選取了20種食用真菌與山楂共發(fā)酵，以總黃酮的含量為考察指標(biāo)，得出生長率、轉(zhuǎn)化率最高的食用真菌。結(jié)果顯示，經(jīng)蛹蟲草與山楂共發(fā)酵后發(fā)酵液中總黃酮含量最高，為空白對照的1.76倍；通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，因為響應(yīng)面法既能提供各影響因子的交互作用，又能確保試驗值與理論值相差較小，具有精確度高的特點[25-26]。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面優(yōu)化分析得到總黃酮發(fā)酵最佳工藝條件：發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度25 ℃、接種量6.0%、料液比為1∶35（g∶mL）。在此條件下，山楂發(fā)酵液中總黃酮含量為42.8 mg/g，進(jìn)一步證明通過微生物輔助發(fā)酵是可以有效提高山楂發(fā)酵液中總黃酮的含量，其原因可能與微生物中某種酶催化了某些總黃酮類化合物前體及酶還原某些總黃酮類化合物的衍生物有關(guān)，但中藥發(fā)酵過程復(fù)雜，總黃酮含量增加的機制是什么，還有沒有其他微生物可更大幅度提高總黃酮含量，這些問題尚需進(jìn)一步研究。微生物輔助發(fā)酵可有效提高山楂中總黃酮的含量，響應(yīng)面優(yōu)化得到的共發(fā)酵工藝具有總黃酮含量高、精度高、工藝穩(wěn)定的優(yōu)點，可在生產(chǎn)中應(yīng)用并推廣。