吳 芳，王 璨，譚 智，張雨相，易小明

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)，每年發(fā)病例數(shù)達43萬，占據(jù)所有惡性腫瘤的第11位，年齡標化病死率達4.6/100 000[1]。膀胱癌的臨床治療方式包括手術(shù)治療、化療、放射治療及生物治療等；但因膀胱癌腫瘤的異質(zhì)性較大，復(fù)發(fā)率高，對于肌層浸潤性膀胱癌更易出現(xiàn)局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移，此類患者遠期生存預(yù)后不佳[2]。因而有必要深入研究其分子機制，尋找新的診斷治療靶點。長鏈非編碼RNA(long-noncoding RNA, LncRNA)DDX11-AS1，位于12p11.21，又稱為內(nèi)聚調(diào)節(jié)劑非編碼RNA，在胃癌、肝癌及乳腺癌等腫瘤中均存在異常表達的現(xiàn)象[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA DDX11-AS1廣泛參與真核生物多種細胞中基因轉(zhuǎn)錄激活，通過促進下游如緊密連接蛋白7基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移及化療耐藥性的產(chǎn)生[5]。層黏連蛋白亞基α3(laminin subunit alpha 3, LAMα3)基因位于1q32.2，該基因編碼產(chǎn)物屬于基底膜蛋白家族。LAMB3蛋白是層黏連蛋白β亞基，與α和γ亞基一起形成層黏連蛋白5。LAMB3廣泛參與許多生物過程，如細胞黏附、遷移及與其他細胞外基質(zhì)成分的相互作用。研究表明，LAMB3在甲狀腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、肝細胞癌和胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[6-7]。但LAMB3在膀胱癌中的潛在調(diào)控機制及臨床意義尚不清楚。本研究通過免疫組化方法檢測了膀胱癌的癌組織中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA和蛋白表達水平，初步探討兩者的表達與臨床病理特征的關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 回顧性分析2015年2月—2016年2月我院診治并行手術(shù)治療的84例膀胱癌患者的臨床病理資料。①納入標準：初次發(fā)現(xiàn)；病理學檢查確診為膀胱移行細胞癌；無其他腫瘤病史；既往無手術(shù)、放化療等腫瘤治療史；所有患者對本研究知情同意并簽字。②排除標準：合并間質(zhì)性膀胱炎、膀胱炎等疾?。话橛袊乐匦姆蔚扰K器功能障礙；合并自身免疫系統(tǒng)疾病或精神障礙性疾病。男51例，女33例；年齡31～77(48.3±7.2)歲；病理分級：高分化35例，中低分化49例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期30例；肌層浸潤48例，非肌層浸潤36例；腫瘤直徑≤3 cm者44例，直徑>3cm者40例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準通過。

1.2膀胱癌組織中LAMB3蛋白表達 采用免疫組織化學法檢測，將組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，切片70℃、烤片2 h；二甲苯脫蠟2遍，梯度水化；高壓鍋法抗原熱修復(fù)：3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶；5%羊血清，室溫封閉30 min；滴加足夠量的稀釋好的一抗(LAMB3稀釋比1∶500)，4℃孵育過夜，LAMB3抗體購自Abcam公司，貨號ab97765。二抗室溫孵育2 h；DAB顯色5 min；蘇木精復(fù)染1 min，鹽酸乙醇分化；梯度脫水，封片鏡檢。染色結(jié)果判定：根據(jù)陽性表達部位的染色強度及細胞數(shù)對蛋白表達進行評估。胞質(zhì)不著色為0分，顏色淺為1分，棕黃色顆粒為2分，顏色深為3分。無染色細胞為0分，陽性細胞數(shù)<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。結(jié)果以染色強度評分與陽性細胞數(shù)評分的乘積計算，0～2分判定為陰性，3～9分判定為陽性。

1.3隨訪 所有納入者自出院起開始隨訪，采用電話方式或者門診隨訪方式進行，隨訪內(nèi)容為患者生存情況，每月隨訪1次，總隨訪時間5年。計算5年總體生存率(overall survival, OS)。隨訪截止日期為隨訪時間結(jié)束或患者出現(xiàn)死亡。

2 結(jié)果

2.1LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA表達比較 膀胱癌癌組織中LncRNA DDX11-AS1的相對表達量為0.685±0.114，癌旁組織為0.121±0.022。癌組織中LncRNA DDX11-AS1的相對表達量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。膀胱癌癌組織中LAMB3 mRNA的相對表達量為0.835±0.121，癌旁組織為0.220±0.053，癌組織中LAMB3 mRNA的相對表達量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 膀胱癌患者癌組織和癌旁組織中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA表達情況比較

2.2癌組織與癌旁組織中LAMB3蛋白表達比較 LAMB3棕黃色陽性表達主要位于細胞質(zhì)，少量表達于細胞膜。癌組織與癌旁組織中LAMB3蛋白表達陽性表達率分別為72.619%(61/84)、17.857%(15/84)。癌組織中LAMB3蛋白表達的陽性率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中LAMB3蛋白表達情況(SP×400)

2.3癌組織中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3表達與臨床病理特征的關(guān)系 膀胱癌癌組織中LncRNA DDX11-AS1與LAMB3表達與腫瘤TNM分期、是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度及病理分級無關(guān)(P>0.05)。TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者癌組織中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA表達高于TNM分期I～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織的膀胱癌患者(P<0.05)。見表1。

表1 膀胱癌患者癌組織中LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.4癌組織中LncRNA DDX11-AS1與LAMB3表達的相關(guān)性 膀胱癌患者癌組織中 LncRNA DDX11-AS1表達與LAMB3表達呈顯著正相關(guān)(r=0.564，P<0.01)。見圖3。

2.5不同LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達患者生存預(yù)后比較 84例膀胱癌患者的5年OS為65.476%(55/84)。LncRNA DDX11-AS1高表達組44例，5年OS為54.545%(24/44)；LncRNA DDX11-AS1低表達組40例，5年OS為77.50%(31/40)。與LncRNA DDX11-AS1低表達組相比，LncRNA DDX11-AS1高表達組預(yù)后差(P<0.05)。LAMB3高表達組41例，5年OS為46.341%(19/41)；LAMB3低表達組43例，5年OS為83.721%(36/43)。LAMB3高表達組預(yù)后較LAMB3低性表達組預(yù)后差(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達的膀胱癌患者生存預(yù)后比較

3 討論

我國膀胱癌的發(fā)病率為7.49/100 000，約占我國惡性腫瘤發(fā)病構(gòu)成2.50%；多數(shù)患者確診時已為中晚期，雖然給予積極手術(shù)、化療等綜合治療，但仍有部分膀胱癌患者術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或進展，影響其長期生存[8]。因此，研究膀胱癌的發(fā)病機制并尋找新的診斷治療靶點具有重要臨床意義。非編碼RNA是一類無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA調(diào)控分子?？煞譃槲⑿NA、lncRNA及環(huán)狀RNA等。以往認為非編碼RNA是細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄過程中的“垃圾”，但目前大量研究表明非編碼RNA在細胞分化發(fā)育、代謝及衰老等過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[9]。

LncRNA DDX11-AS1是近年來研究發(fā)現(xiàn)的參與真核生物中多種細胞中基因轉(zhuǎn)錄激活的非編碼RNA分子。研究表明，腫瘤中LncRNA DDX11-AS1能夠通過表觀遺傳學修飾影響癌基因的轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤細胞的無限增殖、代謝重編程及轉(zhuǎn)移等行為，檢測腫瘤中LncRNA DDX11-AS1的表達有利于判斷患者預(yù)后生存時間[10]。本研究結(jié)果顯示，癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達上調(diào)；其表達上調(diào)的機制尚不清楚，可能與腫瘤發(fā)生時轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常有關(guān)。研究表明，腫瘤中促進LncRNA DDX11-AS1表達的轉(zhuǎn)錄因子YY1表達升高，其能結(jié)合到啟動子區(qū)，促進LncRNA DDX11-AS1的表達[5]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達與腫瘤TNM分期、是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤分期越高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中LncRNA DDX11-AS1表達水平較高。表明LncRNA DDX11-AS1的表達能促進膀胱癌的發(fā)生發(fā)展；分析其原因可能為LncRNA DDX11-AS1作為分子海綿，結(jié)合并抑制微小RNA326等，進而導(dǎo)致AKT信號通路的過度激活，AKT促進癌基因如血管內(nèi)皮生長因子、血小板源生長因子受體等表達，促進腫瘤細胞的增殖及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3，11]。有學者通過大規(guī)模RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，肝癌中LncRNA DDX11-AS1異常表達，與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。本研究通過分析LncRNA DDX11-AS1表達與患者生存預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高表達LncRNA DDX11-AS1的膀胱癌患者5年OS較低，表明膀胱癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達促進膀胱癌的進展，檢測癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達有可能成為判斷預(yù)后的標志物，并可能成為新的治療靶點。

LAMB3是層黏連蛋白家族的成員，是基底層的重要的生物活性成分，具有調(diào)控細胞的分化、遷移、黏附、增殖和存活等生物學功能。研究表明，LAMB3參與促進多種惡性腫瘤的進展，影響宮頸癌、頭頸部鱗癌等惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[13-14]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌癌組織中LAMB3 mRNA的相對表達量及蛋白的陽性表達率均明顯高于癌旁組織組，表明癌組織中LAMB3表達上調(diào)。其機制可能是LAMB3的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常有關(guān)。研究表明，微小RNA-24-3p能夠結(jié)合于LAMB3 mRNA的3'非編碼區(qū)，降低LAMB3 mRNA的穩(wěn)定性。而腫瘤發(fā)生時微小RNA-24-3p表達下調(diào)，導(dǎo)致LAMB3表達增加[15]。本研究亦表明，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的癌組織LAMB3表達明顯較高，提示LAMB3促進膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。研究表明，LAMB3表達上調(diào)能夠促進腫瘤細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug等的表達，促進間質(zhì)性表型如波形蛋白等的表達，而上皮性表型如E鈣黏素表達下調(diào)，腫瘤細胞的侵襲能力增強，促進腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤分期升高[16-17]。此外，高表達LAMB3患者5年OS明顯較低，表明癌組織中LAMB3的高表達可能導(dǎo)致膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，有望成為評價預(yù)后的腫瘤標志物。本研究結(jié)果顯示癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達與LAMB3的表達呈明顯正相關(guān)。目前兩者之間相互作用關(guān)系尚不清楚，可能是LncRNA DDX11-AS1可作為內(nèi)源性競爭性RNA結(jié)合并抑制微小RNA-2355的表達，引起微小RNA-2355下游靶基因LAMB3水平升高[18]。因此，兩者均可能是膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中重要標志物，但具體作用機制及臨床意義有待深入研究。

綜上所述，膀胱癌患者癌組織中LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達上調(diào)，且癌組織中LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達水平與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，LncRNA DDX11-AS1、LAMB3參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，有望成為膀胱癌的新腫瘤標志物。