袁秀云 許申平 周一冉 王喜蒙 崔 波*

（1. 鄭州師范學院生物工程研究中心，鄭州 450044；2. 鄭州大學生命科學學院，鄭州 450001）

光照是植物生長發(fā)育必需的環(huán)境因子，不僅為植物進行光合作用提供能量，還對植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成和生理代謝等產(chǎn)生重要影響［1～3］。在長期的生存適應(yīng)進程中，植物演化出陰生、陽生和耐陰三大需光類型［4］。一般來說，陽生植物植株矮小，葉片和角質(zhì)層較厚，柵欄組織發(fā)達，一定范圍內(nèi)的強光可提高其光合速率，而陰生植物則相反，植物葉片較薄、海綿組織疏松、通氣結(jié)構(gòu)發(fā)達，強光不利于其光合作用。在不同光照條件下，陰生植物三七（Panax notoginseng）幼苗的形態(tài)指標、不同器官干質(zhì)量及分配，以及葉片性狀均有明顯變化［5］。遮蔭能夠促進陰生植物金蓮花的生長發(fā)育，其株高、葉片數(shù)、葉面積等指標增大，葉綠體內(nèi)基粒數(shù)和基粒片層顯著增加，淀粉粒數(shù)量減少［6］。陽生植物駱駝刺（Alhagi sparsifolia）在林下的葉面積與自然光下相比顯著降低［7］。對陽生植物玉米（Zea mays）來說，遮蔭使其葉片變薄，葉綠體數(shù)目減少，基粒數(shù)、基粒厚度和片層數(shù)增加［8］。堇葉紫金牛（Ardisia violacea）即不是典型的陰生植物，也不是典型的陽生植物，有較強的耐陰性，在25%遮蔭條件下，其比葉重顯著增大，而60%和90%遮蔭下比葉重顯著減?。?］。這些研究表明，不同需光類型植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)對遮蔭具有不同的響應(yīng)。目前，多種植物如三七［5］、新娘草（Gibasis pellucida）［10］、玉米［8］、連香樹（Cercidiphyllum japonicum）［11］、香果樹（Emmenopterys henryi）［12］等在不同光照條件下的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理代謝均有研究，而不同光照強度對白及生長發(fā)育及葉片結(jié)構(gòu)影響的研究還未見報道。

白及（Bletilla striata）為單子葉蘭科（Orchidaceae）植物，為我國傳統(tǒng)中藥，由于白及自然繁殖率低，長期以來的過度采挖使得野生白及植物資源逐年減少，人工栽培白及已勢在必行［13］，但其栽培生理特性及生長發(fā)育方面的研究還較少。吳明開等的研究表明白及為陰生植物，人工種植時適當遮蔭有利于其生長［14］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)不同光照強度對白及葉片光合速率、葉綠素熒光參數(shù)及抗氧化酶活性等均有不同程度的影響，50%～70%的遮蔭有利于白及的生長發(fā)育，能提高白及葉片的光合速率、表觀量子效率及過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等的活性［15］。然而，白及光合作用對遮蔭響應(yīng)的葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還不太清楚。為此本論文針對與光合作用相關(guān)的植物形態(tài)與葉片結(jié)構(gòu)，以露地大田栽植的白及為試驗材料，設(shè)置3個遮蔭處理，對白及的外部形態(tài)及葉片顯微結(jié)構(gòu)進行觀察分析，以從形態(tài)結(jié)構(gòu)方面進一步解釋白及光合生理響應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為建立白及的人工栽培技術(shù)體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為二年生白及，栽培于鄭州師范學院生物工程研究中心實踐基地，土壤類型為潮土，株間距25 cm×25 cm。2018 年春季采用不同密度遮光網(wǎng)對樣地進行遮蔭處理，遮蔭棚長8 m，寬3 m，遮光網(wǎng)高度1.5 m，每邊遮光網(wǎng)距離地面40 cm，便于通風透氣。設(shè)置3 個遮蔭梯度：50%遮蔭率、70%遮蔭率、90%遮蔭率，以全光照下的白及作為對照（CK）。每處理3 個重復，定期除草，適當澆水。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)的測定

遮蔭處理3 個月后，在各處理樣地內(nèi)隨機取樣，使用卷尺、直尺（精度0.1 cm）測定白及的株高、葉數(shù)，測量自上而下第二片功能葉的葉長、葉寬，葉面積按橢圓公式計算，各處理測6株，另取各處理植株第二功能葉中部葉片組織用于顯微結(jié)構(gòu)的觀察。

1.2.2 葉片氣孔特征參數(shù)的測定

采用印跡法［16］將無色指甲油涂抹在白及葉片下表皮中間部位，20 min 后用鑷子取完全風干的指甲油薄片，制成下表皮臨時裝片。使用光學顯微鏡（Leica DM2500，Germany）觀察氣孔特征，運用Leica application suite 顯微測量軟件對氣孔密度、氣孔器的長度（a）和寬度（b）進行測量，氣孔面積（S）計算每個處理隨機取30 個視野的平均值［11～12］。

式中：a為長；b為寬；π=3.14。

1.2.3 葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)的測定

選取白及葉片中間部位，避開中脈，剪成面積約1 cm×1 cm 的矩形小塊，經(jīng)FAA 固定液固定后，參考Chen 等人的石蠟—冷凍混合切片法［17］，并稍作改進，采用FAA 固定液，經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋等一系列操作后，制成石蠟包埋塊。使用冷凍切片機（Leica CM1950，Germany）切成厚度為6 μm的薄片，對蠟片進行攤片、烤片、脫蠟、1%番紅溶液染色后，在光學顯微鏡下觀察葉橫切面特征，使用Leica application suite 顯微測量軟件測量葉片厚度、上下表皮厚度、葉肉厚度、上下表皮角質(zhì)層厚度、相鄰維管束距離等參數(shù)。

1.2.4 葉片超微結(jié)構(gòu)的觀察

取葉片主脈兩側(cè)組織約1 cm2，4%戊二醛溶液固定，磷酸緩沖液沖洗，依次進行脫水、包埋、切片、染色，VEGA3 TESCAN 型掃描電鏡、JEM-1200EX型透射電鏡下觀察葉片超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遮蔭對白及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

露地大田栽培條件下，冬季白及地上部分全部凋落，春季重新萌發(fā)并快速生長，綠葉期集中在4～9 月，10 月下旬地上部分逐漸枯萎。不同遮蔭條件下白及生長發(fā)育狀況差異較大：CK 處理下白及植株矮小，葉片顏色偏黃，葉脈粗實突出，在光強較高的7 月，葉尖出現(xiàn)棕褐色點狀斑塊；50%和70%遮蔭條件下植株生長旺盛，株型高大緊實，葉脈清晰明顯；90%遮蔭條件下植株葉型寬大，葉片顏色深綠，但長勢較弱，葉脈觸感不明顯（見圖1）。

從表1 可以看出，遮蔭處理和CK 條件下白及葉片數(shù)量沒有顯著差異；而遮蔭處理下的白及株高、葉長、葉寬、葉面積都高于CK，其中以50%遮蔭處理下與對照的差異最大，株高、葉長和葉面積分別比CK 顯著增加了47.56%、40.35%和84.20%。葉寬在90%遮蔭條件下最大，比CK 條件下顯著提高了33.45%。結(jié)果表明，遮蔭處理能夠促進白及地上部分莖葉的生長發(fā)育。

表1 不同遮蔭處理對白及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of different shading treatments on B.striata morphological structure

2.2 遮蔭對白及葉片氣孔特征的影響

白及葉片的氣孔主要分布在下表皮。通過白及葉片下表皮正面觀顯微觀察顯示（見圖2），白及保衛(wèi)細胞呈腎形，不同遮蔭條件下，表皮細胞形態(tài)和大小差異較大。CK 條件下，白及表皮細胞多為不規(guī)則多邊形，較小；隨著遮蔭強度的增加，白及葉片表皮細胞逐漸增大，50%遮蔭條件下，表皮細胞呈不規(guī)則長方形。隨著遮蔭程度增加光照強度的降低，白及葉片氣孔密度呈逐漸減小趨勢。CK條件下，白及葉片氣孔密度為113.50±2.55個/mm2，50%和70%遮蔭條件下顯著降低，氣孔密度為CK條件下的87.22%、85.49%，而90%遮蔭條件下氣孔密度更小，只為CK 條件下的51.11%。氣孔器長、氣孔器寬和氣孔面積均是CK 條件下的最大，70%遮蔭條件下的最小，CK、50%遮蔭和90%遮蔭條件下，三者沒有顯著差異（見表2）。另外電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，CK 條件下，白及葉片表面粗糙，有許多顆粒狀物質(zhì)（見圖2），這些顆粒可能是表皮分泌的角質(zhì)層蠟質(zhì)［18～19］，隨著遮蔭強度的增加，蠟質(zhì)顆粒逐漸減少。

表2 不同遮蔭處理對白及葉片氣孔參數(shù)的影響Table 2 Effect of different shading treatments on B.striata leaves stomatal parameters

2.3 遮蔭對白及葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

白及葉片橫切面結(jié)構(gòu)顯示（圖3），其葉片由上表皮、下表皮、葉肉組織和葉脈組成。上下表皮均由一層細胞構(gòu)成，上表皮沒有氣孔器，細胞較大，呈橢圓形；下表皮細胞相對較小，呈方形至圓形；葉肉細胞呈圓形至橢圓形，沒有柵欄組織和海綿組織分化。

不同遮蔭條件下白及葉片解剖結(jié)構(gòu)有明顯差異（見表3）。主要表現(xiàn)有：50%遮蔭條件下，白及葉片厚度和葉肉厚度明顯增大，葉片厚度分別比70%、CK、90%處理顯著增加了13.92% 、15.76%、22.46%，葉肉厚度比70%、CK、90%處理增加了20.36%、20.65%和27.13%，下表皮厚度在三個遮蔭條件下均顯著增加，而維管束的距離在50%和70%遮蔭條件下顯著減小，在50%遮蔭處理下最小，明顯低于CK 和90%遮蔭處理，90%遮蔭處理下白及葉片相鄰維管束距離最大；各處理條件下白及葉片上表皮厚度沒有明顯差異；上表皮和下表皮角質(zhì)層厚度也沒有明顯差異（數(shù)據(jù)略）。

表3 不同遮蔭處理對白及葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of different shading treatments on B.striata leaf anatomical structure

2.4 遮蔭對白及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

CK 條件下，白及葉片葉綠體多數(shù)呈橢圓形或近球形，分布在細胞周圍，基粒均勻分布在葉綠體中，相對于遮蔭處理，基粒類囊體垛疊層數(shù)較少，基粒類囊體片層間隙小，葉綠體中有少量嗜鋨顆粒和淀粉粒；在50%遮蔭處理下，葉綠體多呈短梭形，葉綠體內(nèi)均勻分布有大量基粒，基粒類囊體垛疊程度較高，類囊體片層較多，類囊體片層空隙較小，與基質(zhì)類囊體分界清晰，邊界整齊，見少量嗜鋨顆粒和多數(shù)淀粉粒；70%遮蔭處理下，葉綠體多數(shù)呈長梭形，有的基粒類囊體邊界模糊，基質(zhì)類囊體片層清晰可見，葉綠體內(nèi)有多數(shù)嗜鋨顆粒和少量淀粉粒；90%遮蔭處理下，多數(shù)葉綠體近呈狹長梭形，基粒類囊體垛疊程度低，基粒類囊體片層數(shù)較少，排列疏松，基質(zhì)類囊體片層更加明顯，片層間具有較大空隙，葉綠體內(nèi)可見嗜鋨顆粒，偶見淀粉粒存在（見圖4）。由此可見，全光照和90%遮蔭下葉綠體超微結(jié)構(gòu)發(fā)育不健全，適當遮蔭有利于葉綠體基粒類囊體片層的發(fā)育和垛疊，其中50%遮蔭條件下白及葉片葉綠體發(fā)育最為完善。

3 討論

陽生植物和陰生植物對光強的適應(yīng)能力不同，其生長發(fā)育和葉片結(jié)構(gòu)對不同光照的反應(yīng)也有差異。對車前（Plantago asiatica）輕度遮蔭會顯著增加其葉片寬度和葉柄長度；重度遮蔭下車前葉長、葉寬、單葉面積及總?cè)~面積顯著增加，但重度遮蔭下葉片數(shù)、株高等指標顯著降低［20］。本研究中，遮蔭對白及葉數(shù)沒有明顯影響，對白及株高、葉長、葉寬、葉面積有顯著影響。3個遮蔭條件下，白及株高明顯高于CK，葉長、葉寬、葉面積顯著高于CK，表明在遮蔭條件下，白及通過增加植株高度從而向高空生長，通過增加葉片面積以獲取更多的光資源；遮蔭處理改變了白及營養(yǎng)器官的生長，增加了白及的縱向生長和橫向生長，有利于白及光合器官的生長發(fā)育，這與藥用植物三七的研究結(jié)果一致［5］。

植物葉片的形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)和光合特性等方面會隨著光環(huán)境的變化而呈現(xiàn)出適應(yīng)性改變［21］。新娘草在25%、50%、75%和95%遮蔭下，葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度均隨光強的降低而顯著降低［10］，顯然，這是遮蔭下的葉片增加光能捕獲及利用效率的適應(yīng)策略。多毛金花茶（Camellia hirsuta）在20%和30%光照條件下，葉片厚度增加，并具有更發(fā)達的柵欄組織和海綿組織，同時其葉片凈光合速率和蒸騰速率也明顯提高［22］，說明20%和30%光照下葉片結(jié)構(gòu)更有利于其對環(huán)境的適應(yīng)且光合能力更強。本研究中，全光照下白及葉片的氣孔密度、氣孔器長、氣孔器寬、氣孔面積明顯高于3 個遮蔭處理，而葉面積明顯低于遮蔭處理；50%和70%遮蔭條件下，葉片厚度增加，維管束距離減小，分析認為，全光照下白及植株周圍的環(huán)境溫度較高，較大的氣孔密度有利于蒸騰作用而快速散熱；遮蔭條件下，葉片面積的增加提高了光合面積，而維管束間的距離縮短有利于提高白及葉片水分運輸速率和碳水化合物的運送能力，這些因素均有利于白及的光合速率。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，在50%和70%遮蔭下，白及葉片的凈光合速率明顯提高，同時具有較高的表觀量子效率、最大凈光合速率、光飽和點以及較低水平的光補償點［15］，說明白及葉片遮蔭下的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理功能相適應(yīng)。同時我們還觀察到全光照條件下的表皮細胞向體外分泌較多的蠟質(zhì)顆粒。據(jù)報道，植物表皮角質(zhì)層蠟質(zhì)具有避免植物體內(nèi)水分過度散失、抵御紫外輻射、防止病蟲害入侵等［23～24］，推測全光照下白及葉片表皮上較多的蠟質(zhì)可能減少光照的傷害或避免水分的過度散失，這一推測還需要進一步試驗驗證。

盡管植物能夠通過形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變適應(yīng)一定程度的弱光和強光，但極度的弱光和強光對植物葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)卻極為不利。全光照、遮光25%和95%條件對新娘草葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了輕微或巨大破壞，造成部分基粒類囊體片層和基質(zhì)類囊體片層的擴張及部分葉綠體解體［10］。熊靜等研究發(fā)現(xiàn)，與100%和6%光照條件相比，15%～52%光照條件下，朱砂根（Ardisia crenata）葉片擁有更多的葉綠體數(shù)量和完整的細胞結(jié)構(gòu)［25］，表明過高或過低的光照條件均會對細胞結(jié)構(gòu)造成損傷。增強光照可以增加玉米葉片葉綠體基粒和基粒片層的數(shù)目，同時基粒片層排列更加緊密；而遮蔭則破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)，使葉綠體數(shù)量、基粒和基粒片層數(shù)量減少［26］。對花生的研究表明，耐陰性強的花生品種在中度弱光下，其葉綠體數(shù)量不變，葉綠體基粒數(shù)、基粒片層數(shù)顯著增多，葉綠體發(fā)育完好，而嚴重弱光下，其葉綠體數(shù)、基粒數(shù)和淀粉粒數(shù)顯著減少，葉綠體基粒片層出現(xiàn)破損［27］。本研究中，隨著遮光強度的增加，白及葉片葉綠體由橢圓形或近球形變?yōu)槎趟笮?、梭形、長梭形，說明葉綠體表面積逐漸增大，是葉綠體對光強變?nèi)醯姆e極適應(yīng)；CK 條件下，葉綠體基粒類囊體片層數(shù)量少，我們前期研究顯示PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）最低［15］，說明全光照對白及造成了光抑制，光合速率較低；50%遮蔭處理增加了白及葉片葉綠體的基粒數(shù)和基粒類囊體片層數(shù)，類囊體片層垛疊緊密［15］，這種結(jié)構(gòu)變化可以增加附著在基粒類囊體上的捕光色素，有利于光能在類囊體的傳遞，進而提高光合效率［28］。而70%和90%遮蔭處理下白及葉綠體基質(zhì)片層逐漸顯現(xiàn)，基粒邊界模糊，特別是90%遮蔭處理下，白及葉片葉綠體基粒片層類似解體，垛疊程度降低，說明重度遮蔭不利于葉綠體的發(fā)育及形態(tài)建成，進而對葉片的光合作用產(chǎn)生不利影響。

總之，不同遮蔭條件對白及的葉片形態(tài)及葉綠體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不同程度的影響，從顯微結(jié)構(gòu)分析，不同光照通過改變白及葉片表皮氣孔密度、角質(zhì)層蠟質(zhì)顆粒多少、葉肉厚度、維管束數(shù)量、葉綠體形狀、葉綠體基粒類囊體和基質(zhì)類囊體發(fā)育等影響白及葉片的光合作用；全光照下葉綠體基粒及類囊體片層數(shù)量少意味著露地大田不是白及最適的光照環(huán)境，50%遮蔭增加葉肉細胞的厚度，有利于葉綠體類囊體的發(fā)育，產(chǎn)生較多的基粒及類囊體片層，增強其垛疊程度，而極度弱光降低了基粒類囊體片層的垛疊程度，不利于葉綠體的形態(tài)建成和發(fā)育。