李全志 劉志強 趙玉霞 孫太振

1.開封市腫瘤醫(yī)院 河南，開封 475000 2.河南大學淮河醫(yī)院 3.河南省腫瘤醫(yī)院

目前肺癌仍是全球性的健康問題， 每年約210萬人被確診為肺癌，約180萬人死于肺癌[1]。 肺癌治療包括手術(shù)、放化療、靶向治療和支持治療等方法，化療已經(jīng)成為臨床治療肺癌的主要手段， 其中順鉑（cisplatin，DDP）是肺癌化療中最常用的藥物[2－3]。 然而，化療藥物耐藥是肺癌治療過程中的一個嚴重問題，往往導致患者生存期縮短，生存質(zhì)量降低[4]。 因此，研究肺癌耐藥機制，尋找抑制和減少腫瘤細胞多藥耐藥產(chǎn)生的藥物成為目前肺癌研究中亟待解決的問題。

欖香烯（elemene，ELE）是姜科植物溫莪術(shù)（郁金）的萜烯類有效活性成分， 主要包括β－ELE、γ－ELE和δ－ELE 3種成分，其中β－ELE已被證明具有較強的抗癌活性，ELE注射液已被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的輔助治療，取得了較好的治療效果[5－6]。研究證明，ELE對腫瘤細胞化療及放療耐藥性具有一定的抑制作用，但其作用機制尚不清楚[7]。 磷脂酰肌醇－3－激酶（phosphatidylinositol－3－kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）信號通路與腫瘤細胞的生長增殖、代謝和耐藥性的產(chǎn)生有著緊密聯(lián)系， 研究認為調(diào)節(jié)該信號通路關(guān)鍵蛋白的表達可能成為治療腫瘤的新途徑[8]。因此，本研究以PI3K/AKT信號通路為切入點，觀察ELE對人肺癌A549細胞系耐藥性的改善作用，初步探究其作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞 人肺癌A549/DDP耐順鉑細胞株購于中科院上海細胞庫。 細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的洛斯維爾帕克紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。每2～3d傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2 試劑與儀器 ELE注射液購于大連華立金港藥業(yè)有限公司（批號：1009171）；DDP購于美國Sigma-Aldrich公司（批號：P4394）；RPMI 1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）染色試劑盒、Transwell小室、基質(zhì)膠、結(jié)晶紫染液、胎牛血清、青鏈霉素混合液（100×）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA） 消化液、苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF）、脫脂奶粉、 聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF） 轉(zhuǎn)印膜均購于北京索萊寶科技有限公司（批號：31800、M1020、3422、356234、G1062、11011-8611、P1400、T1300、P0100、D8340、ISEQ00010）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit 購于美國Thermo Scientific公司（批號：K1622）；B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance-related protein，LRP）、 磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphorylated-phosphatidylinositol-3-kinase，p-PI3K）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 兔源單克隆抗體均購于美國Invitrogen 公 司（ 批 號：MA5-11757、33-6400、MA5-31959、PA5-104853、PA1-16777）； 多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated-protein kinase B，p-AKT）兔源單克隆抗體購于美國CST公司（批號：13342、4060）；羊抗兔二抗購于達文生物有限公司（批號：DW-GAR007）。IX53顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；G:BOX多功能凝膠成像系統(tǒng)購于美國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測不同濃度ELE對A549/DDP細胞增殖能力的影響 收集對數(shù)生長期的A549/DDP細胞，以3×103個/孔的濃度接種于96孔板中， 繼續(xù)培養(yǎng)24h后換液。 將細胞分為A549/DDP組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）和ELE組（含有10、20、40、80、160μg·mL-1ELE的培養(yǎng)基培養(yǎng)），每組設(shè)有5個復孔。 孵育24、48、72h后，加入5mg·mL-1MTT溶液20μL，37℃孵育4h后棄去上清液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μL，充分振蕩混勻后在490nm波長下檢測吸光度（optical density，OD），細胞增殖率（%）=（ODELE組-OD空白孔）/（ODA549/DDP組-OD空白孔）×100%。

1.3.2 MTT法檢測不同濃度ELE對A549/DDP細胞化療藥物耐藥性的影響 細胞收集處理同1.3.1，將細胞分為A549/DDP+DDP組、A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組。 A549/DDP+DDP組加入含DDP的培養(yǎng)基，DDP濃度為0、2、4、8、16、32μg·mL-1；A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組在加入上述濃度DDP的基礎(chǔ)上，分別再加入含20μg·mL-1和40μg·mL-1ELE的培養(yǎng)基，每孔100μL，每組設(shè)有5個復孔，培養(yǎng)48h后加入MTT溶液37℃孵育4h，棄去上清液，加入DMSO 150μL充分振蕩混勻，490nm波長下檢測OD值， 計算各組細胞增殖率和藥物半數(shù)抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）。

1.3.3 ELE對A549/DDP細胞侵襲能力的影響 將細胞分為A549/DDP組、A549/DDP+DDP組、A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組。 A549/DDP組細胞以常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，A549/DDP+DDP組以含4μg·mL-1DDP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組以含4μg·mL-1DDP和終濃度為20μg·mL-1ELE的培養(yǎng)基培養(yǎng)，A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組以含有4μg·mL-1DDP和終濃度為40μg·mL-1ELE的培養(yǎng)基培養(yǎng)。 培養(yǎng)48h后，收集各組細胞，按照2×104個/孔的濃度接種于鋪有基質(zhì)膠的Transwell上室，每孔200μL，下室加入600μL的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12h，取出上室，以甲醇固定20min， 棉簽擦掉上室殘余細胞，1%結(jié)晶紫染色15min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗2遍，置于顯微鏡下觀察，選取4個高倍視野進行細胞計數(shù)，取平均值。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測A549/DDP細胞中Bax和Bcl-2 mRNA的表達水平 細胞分組和處理同1.3.3。 收集各組細胞，加入適量Trizol裂解液提取細胞總RNA， 使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。 引物由日本Takara 公司設(shè)計合成，引物序列見表1。 反應(yīng)體系：dNTPs 0.5μL+5×Buffer 5μL+Taq酶0.3μL+MgCl21.5μL+cDNA模板2μL+上下游引物各1μL，加去離子水至總體積25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s，共40個循環(huán)， 最后72℃延伸10min，4℃5min終止反應(yīng)，實驗重復3次。 采用2-△△CT法計算目的基因mRNA相對表達水平。

1.3.5 Western blot檢測A549/DDP細胞中MDR1、LRP和PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達水平 細胞分組和處理同1.3.3。 收集各組細胞，加入蛋白裂解液冰上裂解20min，離心取上清液，以二辛可酸（bicinchoninicacid，BCA）法測定蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜后，以脫脂奶粉封閉，封閉結(jié)束加入MDR1、LRP、p-PI3K、p-AKT一抗稀釋液（稀釋比例均為1∶2 000），4℃過夜， 洗滌3次，加入羊抗兔二抗孵育2h（稀釋比例為1∶1 000），洗滌3次，滴加電化學（electrochemiluminescence，ECL）發(fā)光液，置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。 以Image J軟件分析各個蛋白對應(yīng)的灰度值， 計算蛋白相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，以GraphPad Prism 8.0作圖。計量資料以x±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用紐曼-科伊爾斯檢驗（Student-Newman-Keuls，SNK-q）。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較 ELE處理24h后，與A549/DDP組比較，10、20μg·mL-1ELE組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），40、80、160μg·mL-1ELE組細胞的增殖能力降低（均P＜0.05），呈劑量依賴性。 處理48h后，與A549/DDP組比較，10μg·mL-1ELE組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），20、40、80、160μg·mL-1ELE組細胞增殖能力呈劑量依賴性降低（均P＜0.05）。 處理72h后，與A549/DDP組比較，10、20、40、80、160μg·mL-1ELE組細胞的增殖能力呈劑量依賴性降低（均P＜0.05）。 采用10μg·mL-1ELE處理A549/DDP細胞，處理24、48、72h的增殖能力差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；采用20μg·mL-1ELE處理細胞，48h時細胞增殖能力低于24h，72h時增殖能力低于24h，但差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），72h時細胞的增殖能力顯著低于24h（P＜0.05）； 采用40μg·mL-1ELE處理細胞，48h時細胞的增殖能力低于24h， 但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），72h時細胞的增殖能力顯著低于24h和48h（均P＜0.05）；采用80和160μg·mL-1ELE處理細胞，48h時細胞的增殖能力顯著低于24h（均P＜0.05），72h時細胞的增殖能力顯著低于24h和48h（均P＜0.05）。 見表2。

2.2 各組細胞化療藥物耐藥性比較 DDP對A549/DDP+DDP組、A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組細胞的IC50分別為（17.63±1.04）μg·mL-1、（10.65±0.78）μg·mL-1、（4.13±0.89）μg·mL-1。 與A549/DDP+DDP 組 比 較，DDP 對A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE 組 和A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE 組 細 胞 的IC50均 降 低（均P ＜0.05）；與A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組比較，DDP對A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組細胞的IC50降低（P＜0.05）。 隨著DDP濃度的增加，DDP對A549/DDP+DDP組、A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組細胞的增殖抑制作用增強，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。在相同濃度DDP作用下， 與A549/DDP+DDP組比較，A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組細胞的增殖抑制能力增強，細胞增殖率下降，而且A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組細胞增殖率低于A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組（均P＜0.05）。 見表3。

表2 不同時間點各組細胞的增殖率比較（±s，%）Tab.2 Comparison of cell proliferation rates of each group at different time points （x±s， %）

表2 不同時間點各組細胞的增殖率比較（±s，%）Tab.2 Comparison of cell proliferation rates of each group at different time points （x±s， %）

注：與A549/DDP組（ELE濃度0μg·mL－1）比較，*P＜0.05；與10μg·mL－1 ELE組比較，▼P＜0.05；與20μg·mL－1 ELE組比較，＆P＜0.05；與40μg·mL－1 ELE組比較，△P＜0.05；與80μg·mL－1 ELE組比較，●P＜0.05；與相同濃度24h比較，○P＜0.05；與相同濃度48h比較，◆P＜0.05Note: Compared with A549/DDP group（concentration of ELE was 0μg·mL－1）， *P＜0.05； compared with 10μg·mL－1 ELE group， ▼P＜0.05；compared with 20μg·mL－1 ELE group， ＆P＜0.05； compared with 40μg·mL－1 ELE group， △P＜0.05； compared with 80μg·mL－1 ELE group， ●P＜0.05；compared with the same concentration of 24h， ○P＜0.05； compared with the same concentration of 48h， ◆P＜0.05

ELE 濃度（μg·mL－1） 24h 48h 72h 0 98.65±8.33 99.33±8.63 99.12±7.36 10 95.34±8.62 93.36±9.66 90.35±8.11*20 93.25±9.61 90.35±7.89* 86.33±8.31*○40 86.76±8.57*▼ 80.14±8.34*▼＆ 65.67±7.54*▼＆○◆80 75.41±7.68*▼＆△ 62.12±7.31*▼＆△○ 48.11±9.27*▼＆△○◆160 45.35±6.36*▼＆△● 32.71±6.54*▼＆△●○ 20.12±8.36*▼＆△●○◆

2.3 各組細胞侵襲能力比較 與A549/DDP組比較，A549/DDP+DDP組、A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞的穿膜數(shù)量均減少（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）；與A549/DDP+DDP 組 比 較，A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE 組 和A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞的穿膜細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）， 其中A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞的穿膜細胞數(shù)量低于A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組（P＜0.05）。 見圖1、2。

2.4 各組細胞中Bax和Bcl－2 mRNA表達水平比較 與A549/DDP 組 比 較，A549/DDP+DDP 組、A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE 組 細 胞Bax mRNA 表 達 水 平 升 高（均P＜0.05），Bcl－2 mRNA 表 達 水 平 降 低（均P＜0.05）； 與A549/DDP+DDP組比較，A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組 和A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE 組 細 胞Bax mRNA表達水平升高（均P＜0.05），Bcl－2 mRNA表達水平降低（均P＜0.05）；進一步比較，A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞Bax mRNA表達水平高于A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組（P＜0.05），Bcl－2 mRNA表 達 水 平 低 于A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE 組（P＜0.05）。 見表4。

表3 不同濃度DDP處理后各組細胞的增殖率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of cell proliferation rates in each group after treatment with different concentrations of DDP（±s，%）

表3 不同濃度DDP處理后各組細胞的增殖率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of cell proliferation rates in each group after treatment with different concentrations of DDP（±s，%）

注：與A549/DDP+DDP組比較，#P＜0.05；與A549/DDP+DDP+20μg·mL－1 ELE組比較，▲P＜0.05Note: Compared with A549/DDP+DDP group， #P＜0.05； compared with A549/DDP+DDP+20μg·mL－1 ELE group，▲P＜0.05

DDP（μg·mL－1）組別16 32 A549/DDP+DDP 組 99.64±10.65 95.61±10.18 85.64±9.33 65.32±9.36 49.61±8.37 35.31±9.42 ＜0.05 A549/DDP+DDP+20μg·mL－1 ELE 組A549/DDP+DDP+40μg·mL－1 ELE 組0 2 4 8 P 值98.97±10.69 85.62±9.12#67.31±8.27#50.14±9.33#38.34±9.62#29.64±8.77#＜0.05 99.31±11.62 75.61±10.61#▲49.31±8.79#▲40.25±8.92#▲30.64±9.44#▲20.74±8.67#▲＜0.05

圖1 Transwell法檢測ELE對A549/DDP細胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，400×）Fig.1 Transwell method to detect the influence of ELE on the invasion ability of A549/DDP cells（crystal violet staining，400×）

圖2 各組細胞侵襲能力的比較Fig.2 Comparison of cell invasion ability in each group

2.5 各組細胞MDR1、LRP及PI3K/AKT信號通路蛋白表達比較 與A549/DDP組比較，A549/DDP+DDP組、A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE 組 和A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞中MDR1、LRP、p－PI3K和p－AKT蛋白相對表達水平顯著降低（均P＜0.05）；與A549/DDP+DDP組比較，A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞中MDR1、LRP、p－PI3K和p－AKT蛋白相對表達水平顯著降低（均P＜0.05）；進一步比較，A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞MDR1、LRP、p－PI3K和p－AKT蛋白相對表達水平低于A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組（均P＜0.05）。 見圖3、表5。

表4 各組細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達水平比較（±s）Tab.4 Comparison of Bax and Bcl-2 mRNA expression levels in each group（x±s）

表4 各組細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達水平比較（±s）Tab.4 Comparison of Bax and Bcl-2 mRNA expression levels in each group（x±s）

注：與A549/DDP組比較，*P＜0.05；與A549/DDP+DDP組比較，#P＜0.05；與A549/DDP+DDP+20μg·mL－1 ELE組比較，▲P＜0.05Note: Compared with A549/DDP group， *P＜0.05； compared with A549/DDP+DDP group， #P＜0.05； compared with A549/DDP+DDP+20μg·mL－1 ELE group， ▲P＜0.05

組別 Bax mRNA Bcl－2 mRNA A549/DDP 組 1.05±0.09 1.01±0.08 A549/DDP +DDP 組 1.88±0.21* 0.79±0.06*A549/DDP+DDP+20μg·mL－1 ELE 組 3.56±0.48*# 0.33±0.02*#A549/DDP+DDP+40μg·mL－1 ELE 組 4.98±0.52*#▲ 0.20±0.02*#▲

3 討論

圖3 Western blot檢測各組A549/DDP細胞MDR1、LRP及PI3K/AKT信號通路蛋白表達Fig.3 Western blot detection of MDR1， LRP and PI3K/AKT signaling pathway protein expression in each group

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在過去的幾十年中，盡管新的治療方法和藥物不斷涌現(xiàn)，但肺癌患者的預(yù)后仍然不佳，5年生存率僅為15%，其主要原因是部分腫瘤細胞早期獲得了化療藥物耐藥性，耐藥的原因包括藥物吸收不良、細胞周期改變、細胞代謝相關(guān)基因失調(diào)等[9－10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路與腫瘤細胞的生長增殖、代謝和耐藥性的產(chǎn)生有緊密聯(lián)系，可通過其上下游分子水平的改變來調(diào)控多種細胞生物的過程，PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和PI3K/Akt/核因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB）等信號通路已被證明與腫瘤的增殖侵襲密切相關(guān)，下調(diào)AKT的表達水平可誘導腫瘤細胞凋亡， 而PI3K基因突變可導致腫瘤細胞對表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）抑制劑產(chǎn)生耐藥性[11－12]。 溫莪術(shù)（郁金）的主要活性成分ELE具有顯著抗腫瘤作用，現(xiàn)已被廣泛用于惡性腫瘤的臨床治療，其機制包括誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期，抑制腫瘤血管新生和細胞遷移， 并可通過降低線粒體膜電位激活細胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)，增加細胞對放化療的敏感性，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[13－15]。目前，雖已有研究報道ELE對人肺癌A549細胞多藥耐藥性具有抑制作用，但其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的作用機制尚不清晰， 因此本研究以PI3K/AKT信號通路為切入點，觀察不同濃度ELE對人肺癌A549細胞系多藥耐藥的改善作用，并初步探究其作用機制。

本研究結(jié)果顯示， 采用不同濃度的ELE處理A549/DDP細胞， 與A549/DDP組比較，10、20、40、80、160μg·mL－1的ELE作用24、48、72h后，A549/DDP細胞的增殖能力均降低，呈顯著劑量依賴性。 作用48h后，20μg·mL－1和40μg·mL－1ELE組A549/DDP細胞的增殖率分別為（90.35±7.89）%和（80.14±8.34）%，因此本研究選擇對細胞抑制率不超過20%的20μg·mL－1和40μg·mL－1濃度進行后續(xù)實驗。 結(jié)果顯示，與A549/DDP組比較，20μg·mL－1和40μg·mL－1ELE分別聯(lián)合DDP處理細胞 后，A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE 組 和A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞對DDP的敏感性顯著增加，提示ELE可以降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性。 為了觀察ELE對A549/DDP侵襲能力的影響，采用Transwell法檢測細胞的侵襲能力。 結(jié)果顯示，與單獨使用DDP比較，A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞的穿膜細胞數(shù)量顯著減少，其中40μg·mL－1ELE與DDP聯(lián)合比20μg·mL－1ELE與DDP聯(lián)合對細胞侵襲能力的抑制作用更強，表明ELE還可以增加DDP對A549/DDP細胞侵襲能力的抑制作用。

表5 各組細胞蛋白相對表達水平比較（±s）Tab.5 Comparison of relative protein expression levels of cells in each group（x±s）

表5 各組細胞蛋白相對表達水平比較（±s）Tab.5 Comparison of relative protein expression levels of cells in each group（x±s）

注：與A549/DDP組比較，*P＜0.05；與A549/DDP+DDP組比較，#P＜0.05；與A549/DDP+DDP+20μg·mL－1 ELE組比較，▲P＜0.05Note: Compared with A549/DDP group， *P＜0.05； compared with A549/DDP+DDP group， #P＜0.05； compared with A549/DDP+DDP+20μg·mL－1 ELE group， ▲P＜0.05

組別 MDR1 LRP p－PI3K p－AKT A549/DDP 組 0.95±0.08 0.94±0.06 0.98±0.09 0.97±0.08 A549/DDP +DDP 組 0.67±0.05* 0.79±0.07* 0.59±0.06* 0.62±0.07*A549/DDP+DDP+20μg·mL－1 ELE 組 0.42±0.04*# 0.65±0.04*# 0.38±0.03*# 0.35±0.04*#A549/DDP+DDP+40μg·mL－1 ELE 組 0.29±0.02*#▲ 0.35±0.02*#▲ 0.25±0.03*#▲ 0.22±0.02*#▲

肺癌細胞的凋亡受到多種基因的調(diào)控，Bcl－2和Bax是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵基因，Bax過表達可促進細胞凋亡，而Bcl－2可與Bax形成二聚體，抑制Bax基因的表達，從而抑制細胞凋亡[16－17]。 RT－PCR結(jié)果顯示，與A549/DDP+DDP組比較，A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE組細胞Bax mRNA表達水平均升高，Bcl－2 mRNA表達水平降低，其 中A549/DDP+DDP+40μg·mL－1ELE 組 細 胞Bax mRNA 表 達 水 平 高 于A549/DDP+DDP+20μg·mL－1ELE組， 而Bcl-2 mRNA表達水平則低于后者， 表明ELE可以促進DDP誘導的A549/DDP細胞凋亡。

PI3K/AKT信號通路貫穿于非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程，該信號通路的活化可激活下游多種信號通路，促進腫瘤的發(fā)展和耐藥性的產(chǎn)生[18]。 Western blot檢測結(jié)果顯示，與A549/DDP+DDP組比較，A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組和A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組細胞MDR1、LRP、p-PI3K和p-AKT蛋白相對表達水平顯著降低， 進一步比較提示A549/DDP+DDP+40μg·mL-1ELE組細胞MDR1、LRP、p-PI3K和p-AKT蛋白相對表達水平低于A549/DDP+DDP+20μg·mL-1ELE組，表明ELE可以逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞對DDP的耐藥性，同時能夠抑制PI3K/AKT信號通路的活化。

綜上所述，ELE可顯著改善人肺癌A549細胞系的多藥耐藥現(xiàn)象， 增加其耐藥株A549/DDP細胞對DDP的敏感性，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥蛋白的表達，抑制其侵襲能力并促進凋亡， 其作用機制與抑制PI3K/AKT信號通路的活化有關(guān)。