施琳俊 楊溪 吳蘇寧 劉偉

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔黏膜病科，國家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面頭頸腫瘤科，上海200011；3.江南大學(xué)附屬醫(yī)院（第三人民醫(yī)院）口腔科，無錫214000

口腔白斑（oral leukoplakia）是一種常見的口腔黏膜潛在惡性疾病，是口腔鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）的重要來源[1]。白斑的癌變率為4%～18%[1-4]。上皮異常增生是白斑重要的病理特征，從無異常增生、輕-中-重度異常增生到癌變進(jìn)程各階段較明確，白斑發(fā)生發(fā)展到癌變是腫瘤發(fā)生的良好研究模型。細(xì)胞低氧感知與響應(yīng)的研究提示細(xì)胞缺氧微環(huán)境是惡性腫瘤發(fā)生的重要條件[5]。微小RNA（microRNA，miRNA）是長度在22 個核苷酸左右的非編碼單鏈RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。研究[6-7]顯示，miRNA 對缺氧應(yīng)答基因起著重要調(diào)控作用，并參與腫瘤發(fā)生。本研究利用人轉(zhuǎn)錄組芯片研究口腔白斑患者病損發(fā)生發(fā)展中的缺氧應(yīng)答基因及相關(guān)miRNA，并驗(yàn)證癌變進(jìn)程中的關(guān)鍵基因及其相關(guān)miRNA的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 材料

納入轉(zhuǎn)錄組芯片研究的組織包括3例正?？谇火つ?、8 例口腔白斑、6 例口腔早期鱗癌（T1-2N0M0）。收集于2014 年9—12 月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔黏膜科和頜面頭頸腫瘤科。8 例口腔白斑中，4 例無/輕度上皮異常增生，4 例中-重度上皮異常增生，本研究將其分別歸為低危白斑和高危白斑。納入差異基因驗(yàn)證表達(dá)研究的組織包括6 例正常黏膜、12 例口腔白斑、12 例口腔早期鱗癌，收集于2018 年6—12 月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔黏膜科和頜面頭頸腫瘤科。以上組織病理學(xué)診斷是依據(jù)世界衛(wèi)生組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[8]，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔病理科醫(yī)師確認(rèn)。組織樣本為活檢或手術(shù)后標(biāo)本，放入裝有RNAlater 液的凍存管，立即置入液氮保存15 min 以上，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療及激素等治療，且無自身系統(tǒng)性疾病和癌癥史。正常黏膜、口腔白斑和早期鱗癌3組患者的年齡和性別等因素均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究對象均簽署知情同意書，本研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2016-80-T37）。

1.2 總RNA提取和質(zhì)檢

按照TRIzol 試劑盒常規(guī)提取組織中總RNA，利用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo Scientific公司，美國）測定濃度及OD260/OD280，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。納入本研究的組織樣本RNA 的OD260/OD280比率均在1.8 和2.1 之間，OD260/OD230值均大于1.8，檢測顯示RNA 質(zhì)量良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.3 轉(zhuǎn)錄組芯片研究

樣本的標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄組學(xué)芯片的雜交以及洗脫檢測按照Affymetrix GeneChip 人轉(zhuǎn)錄組芯片（human transcriptome array，HTA）2.0 標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。首先，總RNA 反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進(jìn)一步合成cRNA，接著對cRNA進(jìn)行第2輪反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，片段化并與生物素標(biāo)記后與芯片雜交，洗脫和染色后掃描得到原始圖像。采用Affymetrix Gene-Chip Command Console 軟件處理提取原始數(shù)據(jù)和Expression Console 軟件對芯片進(jìn)行基因水平的標(biāo)準(zhǔn)化。利用Genespring 軟件分析差異基因，根據(jù)t檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0 且P值＜0.05。接著，對差異基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能分析，按照GO 生物學(xué)作用分類，篩選出生物學(xué)作用為缺氧應(yīng)答的基因。最后，對差異基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，展示差異基因在不同樣本間的表達(dá)模式。

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）

利用HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）將待測RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Roche LCPDS2軟件設(shè)計(jì)引物，缺氧關(guān)鍵基因低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α）、趨化因子配體2（chemokine cc-motif ligand 2，CCL2）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP3）和miRNA的引物序列見表1。利用QuantiFast?SYBR?Green 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（Qiagen 公司，德國）在LightCycler?480 Ⅱ型熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士）上進(jìn)行反應(yīng)。體系：2×QuantiFast?SYBR?Green PCR Master Mix，5 μL；10 μmol·L-1Forward primer，0.2 μL；10 μmol·L-1Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每℃采集5 次熒光信號。GAPDH 和ACTB 分別作為mRNA 和mi-RNA 的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法測定相對表達(dá)水平，設(shè)置3個重復(fù)孔，計(jì)算其均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 缺氧關(guān)鍵基因和miRNA的引物序列Tab 1 Primer sequences of hypoxia key gene and miRNA

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用方差分析比較各組間基因定量表達(dá)的差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。利用STRING-蛋白質(zhì)相互作用線上數(shù)據(jù)庫對白斑癌變?nèi)毖鯌?yīng)答蛋白的相互作用構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，利用miRWalk 綜合型的miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-21-5p 的靶基因與白斑發(fā)生發(fā)展缺氧應(yīng)答相關(guān)基因取交集。

2 結(jié)果

2.1 口腔白斑病各階段的差異表達(dá)基因

轉(zhuǎn)錄組芯片檢測結(jié)果顯示：正常黏膜與低危白斑間有855個差異基因，低危白斑與高危白斑間有399 個差異基因，高危白斑與早期鱗癌間有797個差異基因（圖1）。

圖1 口腔正常黏膜、低危白斑、高危白斑和早期鱗癌組間的差異基因數(shù)目Fig 1 The number of differential genes in normal mucosa，lowrisk oral leukoplakia，high-risk oral leukoplakia and SCC

2.2 口腔白斑病各階段的缺氧應(yīng)答差異表達(dá)基因

GO 功能分析結(jié)果表明，正常黏膜與低危白斑間有7個缺氧應(yīng)答差異基因，低危白斑與高危白斑間有10 個缺氧應(yīng)答差異基因，高危白斑與早期鱗癌間有21 個缺氧應(yīng)答差異基因（圖2），具體基因名稱和位點(diǎn)見表2。

圖2 正常黏膜、低危白斑、高危白斑和早期鱗癌的組間差異缺氧應(yīng)答基因數(shù)目Fig 2 The number of differential hypoxia genes in normal mucosa，low-risk oral leukoplakia，high-risk oral leukoplakia and SCC

2.3 口腔白斑病各階段的差異miRNA

轉(zhuǎn)錄組芯片檢測結(jié)果顯示：正常黏膜與低危白斑間有56 個差異miRNA，差異最大的前3 位是miR-12 （下調(diào)18.75 倍）、miR-124 （上調(diào)10.19倍）、miR-367（下調(diào)4.30 倍）；低危白斑與高危白斑間有25 個差異miRNA，差異最大的前3 位是miR-118（上調(diào)3.84 倍）、miR-934（下調(diào)2.82 倍）、miR-98（下調(diào)2.67 倍）；高危白斑與早期鱗癌間有68 個差異miRNA，差異最大的前3 位是miR-675（下調(diào)8.67 倍）、miR-650（上調(diào)4.11 倍）、miR-21（上調(diào)3.71倍）（圖3）。

表2 口腔白斑病各階段的缺氧應(yīng)答差異表達(dá)基因Tab 2 Differential hypoxia gene expression in each stage of oral leukoplakia

圖3 正常黏膜、低危白斑、高危白斑和早期鱗癌的組間差異miRNA數(shù)目Fig 3 The number of differential miRNA in normal mucosa，lowrisk oral leukoplakia，high-risk oral leukoplakia and SCC

2.4 白斑癌變?nèi)毖鯌?yīng)答基因和miR-21的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

高危白斑到早期鱗癌這一關(guān)鍵階段的21 個差異缺氧應(yīng)答基因和miR-21 的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析結(jié)果顯示：HIF1α、CCL2 和MMP3 位于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的關(guān)聯(lián)中心，可視作關(guān)鍵基因。miRWalk數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因顯示：miR-21 的靶基因與其中10個缺氧應(yīng)答差異基因相關(guān)聯(lián)。

2.5 白斑缺氧應(yīng)答基因和miRNA的驗(yàn)證

qRT-PCR 結(jié) 果表明：HIF1α、CCL2、MMP3的mRNA 和miR-21 在正常黏膜、口腔白斑和早期鱗癌中的相對表達(dá)量均呈階梯式升高，在白斑與早期鱗癌之間的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4），這與轉(zhuǎn)錄組芯片結(jié)果基本一致。

3 討論

口腔黏膜白斑癌變是由多基因異常參與的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變的多步驟過程，高危白斑的早期診斷及危險(xiǎn)評估尤為重要。目前，臨床上常用視診、觸診、常規(guī)病理學(xué)進(jìn)行口腔癌前病變的診斷和評估，而細(xì)胞基因改變發(fā)生于組織形態(tài)學(xué)改變之前，研究白斑發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中基因組學(xué)改變對癌變早期診斷及分子機(jī)制研究具有重要作用。單個或數(shù)個分子蛋白不足以闡明白斑與鱗癌之間的差異[9-10]，高通量的組學(xué)研究可能更具有優(yōu)勢。本研究選取的Affymetrix GeneChip HTA 2.0 芯片是新一代全轉(zhuǎn)錄組芯片，該芯片設(shè)計(jì)了近700萬條探針，可以檢測超過28 萬條全長轉(zhuǎn)錄本，包括超過24 萬條編碼轉(zhuǎn)錄本RNA 和超過4 萬條非編碼轉(zhuǎn)錄本RNA。

圖4 缺氧應(yīng)答基因HIF1α、CCL2、MMP3 mRNA和miR-21在正常黏膜、白斑和早期鱗癌中的表達(dá)Fig 4 Expression of HIF1α, CCL2, MMP3 mRNA and miR-21 in normal mucosa, oral leukoplakia and SCC

納入轉(zhuǎn)錄組芯片的梯度式病例設(shè)置是本研究的特色。針對口腔白斑的發(fā)生發(fā)展，本研究設(shè)置4種病例，正常黏膜（n=3）、低危白斑（n=4）、高危白斑（n=4）、早期鱗癌（n=6），模擬白斑癌變的多步驟進(jìn)程，研究結(jié)果可反映白斑癌變不同階段的分子生物學(xué)特性。回顧文獻(xiàn)，學(xué)者們對此也進(jìn)行過相應(yīng)研究，如對正常黏膜（n=3）和白斑（n=3）進(jìn)行Affymetrix U133 plus 2.0 基因芯片研究[11]，對正常黏膜（n=10）和白斑（n=10）進(jìn)行Agilent 基因組學(xué)芯片研究[12]，對白斑（n=3）和鱗癌（n=3）進(jìn)行SupperArray基因芯片研究[13]。而本研究的芯片病例設(shè)置為白斑發(fā)生發(fā)展的各階段，這是區(qū)別于既往的對白斑的芯片研究的特色之處。由于研究的病例數(shù)較少，故又通過qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因表達(dá)。

細(xì)胞低氧微環(huán)境與腫瘤發(fā)生有著緊密的聯(lián)系。研究[5]表明，腫瘤超過1～2 mm3須依賴血管生成和氧氣，腫瘤內(nèi)部由于癌細(xì)胞不受控的快速分裂增殖，導(dǎo)致大量細(xì)胞聚集在一起，卻沒有血管可以帶來養(yǎng)分和氧氣，腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞通常會陷入低氧環(huán)境中，從而通過HIF-1α 開啟或增強(qiáng)一系列基因的表達(dá)，其中包括促進(jìn)能量物質(zhì)無氧酵解的酶，導(dǎo)致癌細(xì)胞規(guī)避失巢凋亡并啟動遷移機(jī)制的信號通路。段寧等[14]對白斑（n=4）和鱗癌（n=4）進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性芯片研究，發(fā)現(xiàn)異?；蛑饕挥诘?、5～9、11、13～15、17、18染色體。本項(xiàng)目篩選出的缺氧相關(guān)基因位點(diǎn)亦多位于這些染色體。

本研究中轉(zhuǎn)錄組芯片篩選出白斑發(fā)生發(fā)展各階段的缺氧應(yīng)答基因，重點(diǎn)關(guān)注從高危白斑到早期鱗癌這一階段的關(guān)鍵基因。研究表明，HIF1α、CCL2 和MMP3 位于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的關(guān)聯(lián)中心，可視作關(guān)鍵基因。挑選miR-21 作為關(guān)鍵miRNA，其主要原因是miR-21 與缺氧應(yīng)答關(guān)系密切，是調(diào)控缺氧應(yīng)答反應(yīng)的關(guān)鍵miRNA[15]。qRTPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIF1α、CCL2和MMP3 mRNA和miR-21在白斑發(fā)展到早期鱗癌過程中顯著上調(diào)。從HIF-1α 和miR-21 在癌癥中的功能研究看：缺氧下的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的胞外囊泡顯著增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖、存活率、侵襲性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及巨噬細(xì)胞M2 偏振，沉默miR-21 可顯著消除缺氧下的胞外囊泡對癌癥和巨噬細(xì)胞M2極化，表明缺氧微環(huán)境下通過細(xì)胞外囊泡中的miR-21 上調(diào)可顯著減少肺癌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化來促進(jìn)肺癌的發(fā)展；miR-21 在放療抵抗的肺癌細(xì)胞中上調(diào)HIF1α，并促進(jìn)糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)，通過HIF1α基因沉默可抑制糖酵解并使肺癌細(xì)胞對放療重新敏感，而在miR-21 抑制的放療抵抗細(xì)胞中HIF1α過表達(dá)可導(dǎo)致肺癌細(xì)胞重獲放療抵抗，表明miR-21 通過上調(diào)HIF1α 和促進(jìn)糖酵解增加放療抵抗作用；此外，缺氧微環(huán)境可上調(diào)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 中的HIF-1α 和miR-21 表達(dá)，其機(jī)制可能是上調(diào)的miR-21 通過多個信號通路調(diào)控靶基因進(jìn)而影響癌細(xì)胞的增殖及凋亡。

目前，缺氧應(yīng)答基因與口腔潛在惡性疾病的相關(guān)研究較少，本研究的結(jié)果提示HIF-1α 等基因和miR-21 導(dǎo)致的缺氧響應(yīng)在癌變進(jìn)程中具有重要性，白斑癌變微環(huán)境中miR-21 與HIF-1α 的信號通路和分子機(jī)制值得進(jìn)一步研究。本文為白斑發(fā)病和癌變的分子機(jī)制、尋找白斑早期診斷的分子標(biāo)記的深入研究提供新依據(jù)，為白斑的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和標(biāo)志性癌變基因探針的篩查奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。