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microRNA-146a對牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激下淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用

2021-02-26 05:41司雨婷宋金花方珍韓曉哲蔣少云
華西口腔醫(yī)學(xué)雜志 2021年1期
關(guān)鍵詞:纖維細(xì)胞牙周牙周炎

司雨婷 宋金花 方珍 韓曉哲 蔣少云

1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科,天津300070;2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心牙周科,深圳518036;3.美國哈佛大學(xué)牙學(xué)院Forsyth研究所,美國劍橋02146

牙周炎是一種慢性感染性疾病,免疫炎癥機(jī)制起了重要作用,其中包括淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子[1-2]。淋巴細(xì)胞既可以保護(hù)機(jī)體,也可以引起牙周組織的破壞[2-4]。microRNAs(miRs)約含有22個(gè)堿基,能通過結(jié)合靶基因的非轉(zhuǎn)錄區(qū)下調(diào)靶基因的表達(dá),從而在炎癥免疫中扮演關(guān)鍵的角色[5-7]。已有研究[8-9]表明miRs 在牙周炎中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-128能調(diào)節(jié)牙周致病菌——牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)刺激下巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[10],miR-24 作為負(fù)調(diào)節(jié)因子參與被P. gingivalis脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活的巨噬細(xì)胞極化[11]。miR-146a缺乏導(dǎo)致T濾泡輔助細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞的聚集,增強(qiáng)生發(fā)中心反應(yīng)[12]。而且P. gingivalis能激活淋巴細(xì)胞引起牙周炎癥[13-14]。前期研究[15-17]發(fā)現(xiàn)miR-146a 能抑制人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞和B 細(xì)胞分泌因子,如白細(xì)胞介素(interleukin,IL)1β、IL-6 和腫瘤壞死因子α,從而參與牙周炎的調(diào)節(jié)。雖然淋巴細(xì)胞在牙周炎免疫調(diào)節(jié)過程中起著重要的作用[2],但miR-146a如何調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞尚不知。本研究目的是探索miR-146a對P. gingivalisLPS 刺激下淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌的作用,為進(jìn)一步闡明miR-146a 對牙周炎癥的調(diào)節(jié)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

C57BL/6小鼠(8~10周,美國Jackson實(shí)驗(yàn)室);改良伊格爾培養(yǎng)液(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、左旋谷氨酸和兩性霉素B、ACK 紅細(xì)胞裂解液(Gibco 公司,美國),P.gingivalisLPS(Strain ATCC 33277,InvivoGen 公司,美國),miR-146a 模擬物、miR-146a 抑制劑或陰性RNA 對照、HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen 公司,美國),PureLink?RNA Mini Kit 和SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen 公司,美國),LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster(Roche 公司,德國),小鼠IL-1β、IL-6、IL-10 免疫酶聯(lián)反應(yīng)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)MAXTM試劑盒(Biolegend 公司,美國),小鼠Trance 和骨保護(hù)素(osteoprotectin,OPG)ELISA DuoSet試劑盒(R&D system公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠淋巴細(xì)胞的提取和培養(yǎng) 根據(jù)美國Forsyth研究所的研究動物使用指南,處死C57BL/6小鼠(動物倫理編號:17-002),進(jìn)行解剖。收集脾臟,在培養(yǎng)液(10%胎牛血清,100 units·mL-1青霉素,100 μg·mL-1鏈霉素,2 mmol·L-1左旋谷氨酸,0.25 μg·mL-1兩性霉素B)中輕柔研磨。1 500 r·min-1離心5 min 收集細(xì)胞。用1 mL ACK 紅細(xì)胞裂解液處理,去除紅細(xì)胞。離心后懸浮于培養(yǎng)液,以每孔1×106個(gè)接種于96 孔板中。根據(jù)對細(xì)胞采用的刺激物(1 μg·mL-1P. gingivalisLPS、miR-146a 模擬物、miR-146a 抑制劑或陰性RNA 對照)不同,將實(shí)驗(yàn)分為6 組,分別為P. gingivalisLPS 未刺激組、P. gingivalisLPS 刺激組、P. gingivalisLPS/miR-146a 模擬物組、P. gingivalisLPS/模擬物陰性RNA 對 照 組、P. gingivalisLPS/miR-146a 抑 制 劑組、P.gingivalisLPS/抑制劑陰性RNA 對照組。處理細(xì)胞24 h 后收集培養(yǎng)的上清液和淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以每孔1×106細(xì)胞接種于96孔板,37 ℃和5%CO2培養(yǎng)2 h。miR-146a 模擬物、抑制劑和陰性RNA 對照(終濃度10 nmol·L-1)與HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑混合,室溫中放置10 min,形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。加入細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h。隨后用1 μg·mL-1P. gingivalisLPS 刺激,24 h 后檢測細(xì)胞因子的表達(dá)。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR) 用Pure-Link? RNA Mini Kit 提取總RNAs。SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。IL-1β、IL-6、IL-10、OPG、細(xì)胞核因子κB 受體活化因子配體(receptor activator NF-κB ligand,RANKL)、甘油乙酰三磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 和U6 small nuclear RNA 引物見表1[17-18]。GAPDH 和U6 分 別作為mRNA 和miRs內(nèi)參。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.2.4 ELISA 反應(yīng) 使用小鼠ELISA 試劑盒分析IL-1β、IL-6、IL-10、RNAKL、OPG 的分泌。收集的上清液加入抗體包被的96 孔板中孵育后用含0.1% Tween 的PBS 沖洗。與一抗和二抗反應(yīng)后,加入底物,37 ℃孵育15~30 min。加入終止液后用微板讀數(shù)儀(Bio-tek 公司,美國)在450 nm 波長檢測光密度(optical density,OD)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2 次。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。兩組間數(shù)據(jù)用雙側(cè)Student’st檢驗(yàn)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 P. gingivalis LPS 刺激淋巴細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子

與P.gingivalisLPS未刺激組相比較,1 μg·mL-1P.gingivalisLPS 刺激后炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 和RANKL 的mRNA 水 平 升 高(P<0.05),OPG 的mRNA 水平明顯下降(表2)。ELISA 結(jié)果顯示:1 μg·mL-1P. gingivalisLPS 刺激后炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 和RANKL 的分泌明顯升高(P<0.05),而OPG 的分泌無明顯改變(P>0.05)(表3)。這些數(shù)據(jù)提示P.gingivalisLPS 能影響淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。

表2 P.gingivalis LPS對淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA水平的影響Tab 2 The effects of P. gingivalis LPS on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes

表3 P.gingivalis LPS對淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用Tab 3 The effects of P. gingivalis LPS on the secretion of cytokines in lymphocytes

2.2 P. gingivalis LPS 刺激對淋巴細(xì)胞中miR-146a表達(dá)的影響

1 μg·mL-1P. gingivalisLPS 刺激后用qRT-PCR檢測miR-146a 的表達(dá)情況。與非LPS 刺激組(0.95±0.19)相比較,1 μg·mL-1P.gingivalisLPS刺激后,miR-146a 的表達(dá)明顯升高(1.76±0.73)(t=2.778,P=0.019 5),說明miR-146a可能參與P.gingivalisLPS刺激后淋巴細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

2.3 miR-146a 模擬物對P. gingivalis LPS 刺激下淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用

miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后用1 μg·mL-1P.gingivalisLPS 刺激,24 h 后檢測IL-1β、IL-6、IL-10、OPG和RANKL的表達(dá)。與P.gingivalisLPS/模擬物陰性RNA 對照組(1.81±0.56)相比,miR-146a 模擬物能明顯升高miR-146a(10.65±0.82)的水平(t=15.42,P=0.000 1),miR-146a升高明顯抑制IL-1β、IL-6和RANKL mRNA 的表達(dá)和分泌,但是促進(jìn)IL-10 和OPG 的mRNA 表 達(dá)和 分 泌(P<0.05)(表4、5)。

2.4 miR-146a 抑制物對P. gingivalis LPS 刺激下淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用

miR-146a抑制物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后用1 μg·mL-1P.gingivalisLPS 刺激,檢測IL-1β、IL-6、IL-10、OPG和RANKL 的表達(dá)。與P. gingivalisLPS/抑制劑陰性RNA 對照組(1.76±0.38)相比,miR-146a 抑制物能明顯抑制細(xì)胞內(nèi)miR-146a(0.36±0.09)的水平(t=6.209,P=0.003 4),miR-146a 水平降低后明顯促進(jìn)IL-1β、IL-6 和RANKL mRNA 表達(dá)和分泌,但是抑制IL-10 和OPG 的mRNA 表達(dá)和分泌(P<0.05)(表6、7)。

表4 miR-146a 模擬物對P. gingivalis LPS 刺激的淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA水平的影響Tab 4 The effects of miR-146a mimics on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

表5 miR-146a 模擬物對P. gingivalis LPS 刺激的淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用Tab 5 The effects of miR-146a mimics on the secretion of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

表6 miR-146a 抑制物對P. gingivalis LPS 刺激的淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA水平的影響Tab 6 The effects of miR-146a inhibitor on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

表7 miR-146a抑制物對P.gingivalis LPS刺激的淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用Tab 7 The effects of miR-146a inhibitor on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

3 討論

淋巴細(xì)胞在牙周炎的發(fā)病過程中起著重要作用[19],參與牙周炎中牙齦炎癥和牙槽骨的喪失[4]。miR-146已經(jīng)被認(rèn)為通過調(diào)節(jié)炎性因子的分泌在炎癥中起著保護(hù)性作用[15-17]。

IL-1β 參與牙周炎的炎癥反應(yīng)。齦溝液和唾液中IL-1β 水平升高與牙周炎的進(jìn)展密切相關(guān)[20-21]。IL-1β 具有雙向功能:低濃度時(shí)(生理健康水平)促進(jìn)成骨作用,但是高濃度時(shí)能抑制牙周膜干細(xì)胞的成骨過程,后者是修復(fù)牙槽骨的主要細(xì)胞[22]。同樣,IL-1β 能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型極化,后者負(fù)責(zé)骨組織的吸收[23]。本研究發(fā)現(xiàn):P. gingivalisLPS能促進(jìn)淋巴細(xì)胞中IL-1β表達(dá)。IL-1β升高能阻礙牙周膜干細(xì)胞的成骨過程,加速骨吸收,不利于骨組織的修復(fù)和再生。miR-146a 升高能下降IL-1β,抑制miR-146a 能促進(jìn)淋巴細(xì)胞中IL-1β 的水平,說明miR-146a通過調(diào)節(jié)IL-1β在淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的骨修復(fù)和骨吸收中起著保護(hù)性的作用。

作為主要炎性因子之一的IL-6 在牙周炎中起著重要的作用。有研究顯示:齦溝液中IL-6 濃度與牙周炎的臨床指標(biāo)呈正相關(guān)性[21,24],而且參與局部B細(xì)胞反應(yīng)[21]。P.gingivalisLPS能促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞中IL-6 的分泌[15-16]。本研究證實(shí)P. gingivalisLPS 能明顯提高淋巴細(xì)胞中IL-6 的水平,miR-146a 能降低淋巴細(xì)胞中IL-6 的產(chǎn)生,但抑制miR-146a 能促進(jìn)淋巴細(xì)胞中IL-6 的水平,與其他的研究[17]相一致,這些結(jié)果說明miR-146a 通過降低淋巴細(xì)胞分泌IL-6,減少IL-6促進(jìn)的牙周炎癥。

IL-10 作為抗炎細(xì)胞因子,通過抑制破骨細(xì)胞引起的骨吸收,促進(jìn)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成來維持骨量[24-25]。T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和其他的牙周細(xì)胞能分泌IL-10[10,26-27]。Zhang等[24]發(fā)現(xiàn):慢性牙周炎和侵襲性牙周炎患者的齦溝中IL-10 水平明顯升高。雖然研究[10]顯示:抑制miR-146a 不改變?nèi)搜例l成纖維細(xì)胞分泌IL-10,而且抗IL-10 抗體能保護(hù)P.gingivalisLPS 注射的小鼠形成膿腫[27]。P. gingivalisLPS 能促進(jìn)B 細(xì)胞分泌IL-10,miR-146a 抑制B細(xì)胞分泌IL-10,miR-146a 抑制物能促進(jìn)B 細(xì)胞分泌IL-10[17]。但是,本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a 模擬物能促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-10,且其抑制物阻止淋巴細(xì)胞分泌IL-10。從小鼠脾臟獲得的淋巴細(xì)胞是T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的混合細(xì)胞,細(xì)胞之間的交互作用對細(xì)胞因子的分泌起著重要的調(diào)節(jié)作用,從而導(dǎo)致miR-146a 對淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的作用與單純B 細(xì)胞不一致。

RANKL和OPG是調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成的重要因子[28]。RANKL 升高促進(jìn)骨吸收;反之,OPG 升高促進(jìn)骨形成。淋巴細(xì)胞中T 細(xì)胞和B 細(xì)胞是RANKL 和OPG 重要的分泌細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn):P.gingivalisLPS 能抑制淋巴細(xì)胞分泌OPG,促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌RANKL。但是,miR-146a能促進(jìn)淋巴細(xì)胞OPG分泌,抑制淋巴細(xì)胞分泌RANKL,說明即使在炎癥環(huán)境中miR-146a 也能促進(jìn)骨形成,抑制骨吸收。而且以往的研究[29]顯示:miR-146a 能促進(jìn)P. gingivalisLPS 刺激下人牙周膜成纖維細(xì)胞的成骨分化,進(jìn)一步說明了miR-146a 促進(jìn)成骨的效應(yīng)。

綜上所述,miR-146a 能調(diào)節(jié)P. gingivalisLPS刺激下的淋巴細(xì)胞分泌與牙周炎癥相關(guān)的炎性細(xì)胞因子和骨調(diào)節(jié)因子,從而調(diào)控骨改建過程,為牙周骨組織再生的方法提供新的思路。

利益沖突聲明:作者聲明本文無利益沖突。

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