黃志剛，馬克，劉晶

深圳市第三人民醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518100

脊柱結(jié)核是臨床上最為常見的肺外結(jié)核病，而青壯年是脊柱結(jié)核的主要發(fā)患者群。脊柱結(jié)核發(fā)展到晚期時(shí)通常會(huì)發(fā)生脊柱畸形和脊髓神經(jīng)功能損傷，對(duì)患者的日后生活造成嚴(yán)重影響[1]。脊柱結(jié)核患者的臨床及影像學(xué)檢查結(jié)果均無特異性表現(xiàn)，且缺乏特異性實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，現(xiàn)有的各種診斷手段難以滿足早期診斷脊柱結(jié)核的需求。

微小RNA(miRNAs)作為高度保守的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核細(xì)胞中，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡以及機(jī)體神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)的代謝過程中均能夠發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用[2-3]。有研究表明，結(jié)核病患者的體內(nèi)存在miRNAs 的異常表達(dá)，可能與結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，差異化表達(dá)的miRNAs可作為早期診斷結(jié)核病的生物學(xué)指標(biāo)應(yīng)用于臨床[4]。為此，本研究從脊柱結(jié)核患者的外周血血清尋找存在差異化表達(dá)的miRNA，通過對(duì)比其在脊柱結(jié)核患者手術(shù)治療前后的表達(dá)變化，旨在探討將其作為早期診斷脊柱結(jié)核病和評(píng)價(jià)臨床療效的有效標(biāo)志物的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年6月至2018年9月在深圳市第三人民醫(yī)院住院治療的50例脊柱結(jié)核患者作為觀察組，其中男性29 例，女性21 例；年齡25～51 歲，平均(41.83±7.95)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)手術(shù)或穿刺明確證實(shí)為活動(dòng)期脊柱結(jié)核，并最終在本院完成手術(shù)治療，病灶徹底清除，術(shù)后1年內(nèi)完全治愈；(2)同時(shí)具備有較大寒性膿腫、嚴(yán)重骨質(zhì)破壞者；(3)結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性，和/或病理學(xué)檢查顯示干酪樣物質(zhì)者；(4)排除合并脊柱外結(jié)核者。選取同期在我院體檢的50例健康志愿者50例作為對(duì)照組，其中男性31例，女性19例；年齡28～49歲，平均(42.02±8.21)歲。所有對(duì)照組受檢者結(jié)核菌素(PPD)試驗(yàn)與IFN-γ Elispot 檢測(cè)結(jié)果均為陰性。兩組受檢者的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受檢者均詳細(xì)知情并簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及提取miRNAs 采用血清收集管采集觀察組患者術(shù)前、術(shù)后1 年以及對(duì)照組受檢者的空腹外周血各2.5 mL，室溫下靜置1 h 至血液凝固。之后將凝固的新鮮外周血在4℃的環(huán)境下進(jìn)行離心10 min(1 700×g)，收集上層血清，期間注意避免觸及血凝塊，之后將采集的血清在4℃環(huán)境下再次離心10 min(2 000×g)取上清液，經(jīng)低速離心去除沉淀成分后將血清置于-20℃或-80℃冰箱中保存待測(cè)。采用mirVanaTMPARISTMKit將循環(huán)miRNAs提取出來，質(zhì)檢miRNAs，并檢測(cè)其完整性。

1.2.2 篩選miRNAs 對(duì)芯片進(jìn)行預(yù)雜交，吸除后注入雜交液，置入雜交爐中，并旋轉(zhuǎn)雜交。按照芯片數(shù)目，分裝后，將雜交液移除，根據(jù)芯片類型不同，注入同等體積的Wash Buffer A，清洗染色，掃描芯片，掃描時(shí)間由芯片類型不同而異，一般在5～15 min。聚類分析miRNAs 基因芯片。比較組間結(jié)果，按照差異倍數(shù)≥2倍，P＜0.05，篩選有顯著差異的miRNAs。

1.2.3 qRT-PCR 驗(yàn)證 采用實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增(qRT-PCR)技術(shù)，分別檢測(cè)miRNAs的表達(dá)水平。采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的MegaplexTMRNA 逆轉(zhuǎn)錄引物混合物進(jìn)行。針對(duì)每一miRNA，設(shè)計(jì)反向引物，混合后再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得含相同莖環(huán)結(jié)構(gòu)的總cDNA混合物，最后行PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增，形成22 bp左右成熟體miRNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNAs 的表達(dá)譜芯片及qRT-PCR 驗(yàn)證分析 篩選出17 個(gè)有顯著性差異的miRNA，見表1，其中顯著下調(diào)的miRNA有16個(gè)，顯著上調(diào)的miRNA有1個(gè)。聚類分析后，獲得聚類分析熱圖，見圖1。

表1 miRNAs的表達(dá)譜芯片及qRT-PCR驗(yàn)證分析

圖1 miRNAs聚類分析熱圖

2.2 兩組受檢者的血清特異性循環(huán)miRNAs 表達(dá)水平比較 觀察組患者術(shù)前的hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-532-5p 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，hsa-miR-210-3p 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 手術(shù)前后脊柱結(jié)核患者的血清特異性循環(huán)miRNAs 表達(dá)水平比較 觀察組患者在術(shù)后1 年的hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-532-5p 表達(dá)水平明顯高于術(shù)前，hsa-miR-210-3p 表達(dá)水平明顯低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表2 兩組受檢者的血清特異性循環(huán)miRNAs表達(dá)水平比較()

表2 兩組受檢者的血清特異性循環(huán)miRNAs表達(dá)水平比較()

組別觀察組對(duì)照組t值P值例數(shù)50 50 hsa-miR-30c-5p 1.48±0.45 11.35±3.08 22.422＜0.05 hsa-miR-432-5p 1.67±0.32 4.72±1.13 18.364＜0.05 hsa-miR-192-5p 1.84±0.43 5.29±1.49 15.731＜0.05 hsa-miR-532-5p 1.49±0.35 4.11±1.28 13.961＜0.05 hsa-miR-210-3p 3.92±1.34 1.28±0.31 13.573＜0.05

表3 手術(shù)前后患者血清特異性循環(huán)miRNAs表達(dá)水平比較()

表3 手術(shù)前后患者血清特異性循環(huán)miRNAs表達(dá)水平比較()

時(shí)間術(shù)前術(shù)后1年t值P值例數(shù)50 50 hsa-miR-30c-5p 1.48±0.45 10.31±2.29 26.754＜0.05 hsa-miR-432-5p 1.67±0.32 4.01±1.22 13.119＜0.05 hsa-miR-192-5p 1.84±0.43 4.69±1.17 16.167＜0.05 hsa-miR-532-5p 1.49±0.35 3.52±0.87 15.307＜0.05 hsa-miR-210-3p 3.92±1.34 1.86±0.47 10.258＜0.05

2.4 不同miRNA 表達(dá)對(duì)脊柱結(jié)核的診斷效能 hsa-miR-30c-5p 診斷脊柱結(jié)核的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值明顯高于hsa-miR-432-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-532-5p和hsa-miR-210-3p，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 不同miRNA表達(dá)對(duì)脊柱結(jié)核的診斷效能

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，脊柱結(jié)核主要通過臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)及各類結(jié)核病等實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行綜合性診斷。然而，脊柱結(jié)核患者的各項(xiàng)臨床表現(xiàn)以及相關(guān)影像學(xué)特征與化膿性感染、真菌性感染以及骨腫瘤類似，診斷準(zhǔn)確度較低。細(xì)菌培養(yǎng)作為臨床診斷結(jié)核病的重要方式，其在脊柱結(jié)核的陽性率僅有50%左右，且檢查過程耗時(shí)較長(zhǎng)(6～8周)，難以在術(shù)前獲得培養(yǎng)標(biāo)本[5]。多種因素導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)在診斷脊柱結(jié)核上的效果并不理想[6]，目前尚無特異性診斷脊柱結(jié)核的方法[7]。因此，快速、簡(jiǎn)便、特異性和敏感性高的診斷措施十分迫切。

近年來研究證實(shí)，miRNA不僅參與了細(xì)胞的多個(gè)生理生化過程，同時(shí)在癌癥、感染及自身免疫疾病多種疾病中也發(fā)揮著較為重要的作用[8-10]。與細(xì)胞內(nèi)miRNA相比，循環(huán)miRNA具有更好的生物學(xué)特性，可應(yīng)用于肺結(jié)核以及其他多種疾病的臨床診斷中，是一種較為理想的生物標(biāo)記物[11-13]。

本研究在脊柱結(jié)核病患者血清中篩選出17 個(gè)有顯著的差異表達(dá)的miRNA，經(jīng)過qRT-PCR 驗(yàn)證，有5個(gè)表達(dá)量顯著異常。通過對(duì)比兩組受檢者以及脊柱結(jié)核患者在手術(shù)前后的血清特異性循環(huán)miRNAs表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，患者術(shù)前的4個(gè)miRNA表達(dá)水平明顯低于健康體檢者，剩余1 個(gè)的表達(dá)水平明顯高于健康體檢者。脊柱結(jié)核在術(shù)后1年的4個(gè)miRNA表達(dá)水平明顯高于術(shù)前，剩余1個(gè)的表達(dá)水平明顯低于術(shù)前，與芯片結(jié)果一致。通過對(duì)上述的5個(gè)miRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，hsa-miR-30c-5p 與脊柱結(jié)核密切相關(guān)，在骨代謝中發(fā)揮較為重要的作用。hsa-miR-30c 的潛在靶基因?yàn)榉謩e為FLT1、CXCL12、RUNX2，分別負(fù)責(zé)干細(xì)胞特性維持、MSC表型和成骨分化[14-16]。

本研究對(duì)上述5 個(gè)miRNA 在診斷脊柱結(jié)核上的診斷效能進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，hsa-miR-30c-5p 診斷的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為100.00%、96.00%、98.00%、96.15%和100.00%，均明顯高于其余四個(gè)miRNA。上述5 個(gè)miRNA 中，hsa-miR-30c-5p 在診斷脊柱結(jié)核上的診斷效能最佳，其差異化表達(dá)的循環(huán)miRNAs可作為診斷的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。

綜上所述，脊柱結(jié)核存在特異性表達(dá)的循環(huán)miRNAs，差異化表達(dá)的miRNAs對(duì)于進(jìn)一步從分子角度研究脊柱結(jié)核的病理機(jī)制、病情發(fā)展有重要作用。