牛彤旭,王 張,寶魯日,孫 微,師永紅1,
(1.內蒙古醫(yī)科大學,內蒙古 呼和浩特 010000;2.赤峰學院,內蒙古 赤峰 024000;3.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科,內蒙古 呼和浩特 010000)
低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)在調節(jié)腫瘤新血管形成及腫瘤細胞生物學能力中具有重要作用。HIF-1的活性主要由HIF-1α 亞基決定,該亞基受細胞內氧氣濃度的調節(jié),在缺氧環(huán)境下HIF-1α 進入胞核,與HIF-1β結合進而誘導多種靶基因轉錄和表達,促進血管生成和增加腫瘤細胞對低氧環(huán)境的耐受和惡性演進[1]。利用siRNA靶向干擾HIF-1α抑制了細胞的生長和侵襲,促進了細胞凋亡[2,3]。泛素-蛋白酶水解系統(tǒng)是HIF-1α 的主要降解途徑,泛素羧基末端水解酶-3(Ubiquitin C-terminal hydrolases L3,UCH-L3)屬于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)家族成員之一,調控泛素-蛋白酶體降解[4]。本課題組前期蛋白學組研究發(fā)現(xiàn)UCH-L3是MDA-MB-231細胞HIF-1α 的靶蛋白,受HIF-1α 的負性調控;UCH-L3不僅能促進HIF-1α的降解,還能抵消蛋白酶抑制劑(MG231)對HIF-1α蛋白降解的影響,上調UCH-L3削弱了MDA-MB-231細胞的惡性生物學行為[5]。然而關于兩種蛋白在乳腺癌組織中表達的相關性卻未見報道。因此,本研究擬從組織學水平檢測UCH-L3和HIF-1α 在乳腺癌組織、癌旁乳腺組織和良性病變組織中的表達,分析與乳腺癌臨床病理學特征的關系以及兩者之間的相關性,從組織學層面驗證兩種蛋白在人體乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的可能作用,為乳腺癌提供可能的治療依據。
收集內蒙古醫(yī)科大學病理科2016年1月1日~2017年12月31日收治的經病理證實的乳腺癌女性患者99例,年齡30~85歲,中位數55歲。納入標準: 均行手術治療; 術前未行抗腫瘤治療; 具有完整的臨床病理資料。其中83例可用我國常見惡性腫瘤診治規(guī)范的乳腺癌分級標準進行組織學分級,I級12例,Ⅱ級47例,Ⅲ級24例。99例乳腺癌組織中選取38例,將乳腺癌組織及其周圍距離腫瘤小于3 cm的癌旁非腫瘤乳腺組織進行對比,另選取29例乳腺良性病變(包括纖維腺瘤、腺病、導管普通型增生和導管內乳頭狀瘤)患者作為對照組,實驗符合內蒙古醫(yī)科大學生物醫(yī)學科研倫理審批。
Anti-UCHL3兔單克隆抗體(EPR5332)購置于abcam公司,HIF-1α抗體試劑(ZA-0552)購置于中杉金橋公司,采用免疫組織化學染色法(MaxVesion法)。制作厚度為4 μm的組織切片。UCH-L3兔單克隆抗體按1∶300稀釋,HIF-1α為即用型抗體使用羅氏公司的Benchmark XT自動免疫組織化學儀進行染色。
雙盲條件下由兩位病理醫(yī)師獨立打分。本次實驗中UCH-L3表達于細胞質,而HIF-1α 有兩種表達形式,一種為細胞核表達,另一種為細胞質表達。免疫組化染色按如下標準分為:UCH-L3和HIF-1α 胞質染色強度0分為細胞未著色、1分為淺黃色、2分為棕黃色、3分為棕色、4分為黑褐色;HIF-1α 胞核染色強度0分為未著色、1分為淺棕色、2分為棕色、3分為棕黑色;染色比例為陽性腫瘤細胞量占腫瘤總細胞量的百分比;最后綜合分數=染色強度*染色比例(%)。根據綜合分數分為:0分為“陰性”;>0分為陽性,其中包括0.01~0.99分為“”,1~1.99分為“”,2~2.99分為“”,≥3分為“”。
采用SPSS 20.0對數據進行統(tǒng)計分析,計數資料比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法,等級資料比較采用Spearman相關分析、Mann-WhitneyU檢驗和Wilcoxon符號秩和檢驗,檢驗水準(α)為0.05。
UCH-L3在乳腺癌組織、癌旁乳腺組織和良性病變組織中的陽性表達率分別為84.8%、100.0%和93.1%,乳腺癌組織UCH-L3陽性表達率低于癌旁乳腺組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.015),見表1;經過組間兩兩對比,癌旁乳腺組織陽性表達率高于乳腺癌組織。乳腺癌組織UCH-L3的表達強度也弱于癌旁乳腺組織和良性病變組織中(P=0.000和P=0.035),見圖1、2和表2。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α染色結果具有兩種表達形式,一種為細胞核表達;另一種為細胞質表達。HIF-1α胞核陽性表達率在乳腺癌細胞、癌旁乳腺組織細胞和良性病變組織分別為69.7%、10.5%和10.3%,乳腺癌細胞HIF-1α胞核陽性表達率高于癌旁乳腺組織和良性病變組織(P=0.000),見圖3和表1。同樣,HIF-1α 細胞質陽性表達率在乳腺癌組織、癌旁乳腺組織和良性病變組織分別為90.9%、52.6%和79.3%,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000),見表1,經過組間兩兩比較,乳腺癌組織HIF-1α胞質陽性表達率高于癌旁乳腺組織。
表1 乳腺癌、癌旁乳腺組織和良性病變組織中UCH-L3、胞核HIF-1α 和胞質HIF-1α 陽性表達率的比較
A:乳腺癌組織呈中等陽性表達;B:癌旁乳腺組織呈強陽性表達;C:良性病變組織呈強陽性表達。
圖2 UCH-L3在乳腺癌組織呈不同強度表達(IHC 400×)Fig 2 UCH-L3 showed different intensity expression in breast cancer tissues(IHC 400×)
A:乳腺癌組織胞核強陽性,胞質呈中等陽性;B:基底樣型乳腺癌組織胞核中強表達,胞質陰性表達;C:癌旁乳腺組織中呈陰性表達;D:良性病變組織胞質弱陽性。
表2 乳腺癌與癌旁乳腺組織和良性病變組織中UCH-L3表達強度的比較
UCH-L3陽性表達率在Luminal 分型中的 A型乳腺癌(100.0%)中明顯高于基底樣細胞型乳腺癌(73.3%)(P=0.037);組織學分級為I級乳腺癌(100.0%)的UCH-L3陽性表達率高于Ⅲ級(79.2%)。UCH-L3表達率與年齡、pT、pN、病理分型的差異無關(P>0.05),見表3。乳腺癌UCH-L3的表達強度與雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)呈正相關(r=0.258,P=0.010和r=0.292,P=0.003),與人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、Ki-67無相關性(P>0.05)。HIF-1α胞核陽性表達率以Luminal 分型中的HER2過表達型(100.0%)和基底細胞樣型乳腺癌(90.0%)高于Luminal A和B型(P=0.000),見表3。HIF-1α胞核表達強度在乳腺癌與ER、PR呈負相關(r=-0.525,P=0.000和r=-0.438,P=0.000),與Ki-67和組織學分級呈正相關(r=0.390,P=0.000和r=0.367,P=0.001)。與之相反,HIF-1α胞質陽性表達率卻在Luminal分型中以基底細胞樣型表達率最低(73.3%)(P=0.003),見表3。而且,HIF-1α胞質表達強度與ER、PR呈正相關(r=0.299,P=0.003和r=0.359,P=0.000);與Ki-67、組織學分級呈負相關(r=-0.257,P=0.005和r=-0.281,P=0.010)。HIF-1α胞核表達和胞質表達率在各年齡組、pT組、pN組、病理分型均無顯著差別(P>0.05),見表3。
表3 UCH-L3、胞核HIF-1α 和胞質Hif-1α陽性表達率與乳腺癌臨床病理特征的關系
Spearman相關分析顯示,UCH-L3僅與HIF-1α 胞質表達強度呈正相關(r=0.226,P=0.008)。
泛素是一種76個氨基酸的蛋白質,在真核生物中廣泛分布并高度保守。泛素化與翻譯后調控有關,即蛋白質經過泛素偶聯(lián),然后通過蛋白水解酶系統(tǒng)降解。泛素結合通過改變靶蛋白的穩(wěn)定性、定位和/或活性及其動力學來調節(jié)靶蛋白的細胞內活性。然而,泛素化可以被DUBs逆轉,該酶又分為UCHs和泛素特異性加工蛋白酶(ubiquitin specific processing proteases,USPs)[6]。UCH-L3通過水解與靶蛋白連接的泛素鏈,使泛素游離出來,進而達到調控靶蛋白降解的作用[7],參與增殖、分化、凋亡[8]和EMT[9]以及預后[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)UCH-L3在乳腺癌組織表達明顯低于癌旁乳腺組織或良性病變組織;Luminal分型中的基底細胞樣亞型低于Luminal A型,并與ER、PR呈正相關。與本課題組前期體外研究結果相符,即通過病毒表達載體上調乳腺癌細胞細胞系MBA-MB-231的UCH-L3蛋白水平,能夠抑制細胞的增殖和生長、遷移、侵襲以及克隆形成能力[5]。這些提示UCH-L3表達的丟失或降低在乳腺癌的發(fā)生和演進中的確發(fā)揮作用。有研究也顯示,高度轉移性前列腺癌PC3細胞UCH-L3表達水平降低,非轉移性前列腺癌細胞則表達上調,增加PC3前列腺癌細胞UCH-L3的表達,癌細胞侵襲和轉移能力下降[12]。
HIF-1α 是具有氧依賴性特點的核轉錄調控因子[13]。在缺氧條件下,HIF-1α 大量積累于細胞質中,繼而轉入細胞核,形成HIF復合物,誘導靶基因轉錄和表達,促進血管生成,改善腫瘤缺氧,增強腫瘤的增殖、侵襲和轉移能力[14-16]。在正常氧濃度條件下,HIF-1α 與VHL腫瘤抑制蛋白結合,導致HIF-1α 的泛素化和蛋白酶體的降解[1]。本研究在組織學水平上發(fā)現(xiàn)HIF-1α 有細胞核和細胞質兩種表達模式,即細胞核表達和細胞質表達;胞核和胞質HIF-1α 在乳腺癌組織的陽性表達率高于癌旁乳腺組織或良性病變組織;然而HIF-1α 的細胞核和細胞質表達模式與乳腺癌臨床特征之間的關系相反,如乳腺癌胞核HIF-1α 陽性表達增加多見于Ki-67高表達、HER2過表達亞型和基底樣乳腺癌亞型,細胞核表達強度又與ER、PR呈負相關,與Ki67和組織學分級呈正相關;相反,細胞質HIF-1α 表達基底樣型乳腺癌中的陽性表達率明顯最低,HIF-1α 胞質表達強度又與組織學分級和Ki-67呈負相關,與ER和PR表達正相關。是否細胞質HIF-1α 高表達與其向細胞核轉運受抑制有關,其機制尚不清楚。由此可見乳腺癌細胞核HIF-1α 的表達預示著乳腺癌具有更高惡性程度。這與本課題組在乳腺癌細胞系研究結果一致,即降低MDA-MB-231細胞中HIF-1α的表達對細胞生長具有明顯的抑制作用[17],因此HIF-1α 的過表達可能在乳腺癌變和演進過程中發(fā)揮作用,HIF-1α 從細胞質進入胞核預示腫瘤的惡性演進。亦有研究表明許多癌組織和轉移灶中均有 HIF-1α 的過表達,HIF-1α 陽性表達的甲狀腺髓樣癌患者,5年總生存率明顯降低[18]。與肝細胞癌組織HIF-1α 過表達與低存活率,高復發(fā)率和淋巴結高轉移率相關[19]。
本課題組前期研究采用雙向凝膠電泳結合飛行質譜技術對siRNA干擾HIF-1α后的MDA-MB-231細胞中HIF-1的靶蛋白進行了研究。結果表明,與未經siRNA干擾的細胞相比,蛋白質組學檢測到19種下調蛋白和2種上調蛋白,其中的大多數曾被報道為HIF-1的靶蛋白,并首次確定UCH-L3是HIF-1上調的兩種差異蛋白之一,這意味著UCH-L3可能是HIF-1的一個新的直接或間接靶點;通過慢病毒轉染發(fā)現(xiàn)上調UCH-L3降低了MDA-MB-231細胞中游離和泛素結合HIF-1α的表達,并抑制其細胞的生長和克隆性,削弱了細胞的遷移和侵襲能力等惡性生物學行為;UCH-L3不僅能促進泛素從多泛素HIF-1α中分離,進而促進HIF-1α的降解,而且能抵消蛋白酶抑制劑(MG231)對MDAMB-231細胞HIF-1α蛋白降解的影響[5]。而UCH-L3慢病毒過表達載體轉染的雌孕激素受體陽性的乳腺癌細胞系MCF-7細胞,卻表現(xiàn)出HIF-1α 蛋白水平的升高和惡性生物學行為能力的提高。本次試驗從組織學水平上分析了UCH-L3與HIF-1α 的關系,發(fā)現(xiàn)UCH-L3表達在基底樣型乳腺癌中降低,與細胞核HIF-1α 表達正相反。然而UCH-L3與細胞質HIF-1α表達呈正相關,二者均在基底樣亞型最低,可見HIF-1α 由胞質向胞核的遷移不單純與其含量增加有關,UCH-L3對HIF-1α的調控也因乳腺癌的不同分子分型而異。綜上所述,UCH-L3和HIF-1α 對乳腺癌預后的評估具有一定的價值。提高UCH-L3的表達和阻止HIF-1α 由細胞質向細胞核的遷移可為乳腺癌的防治,特別是基底樣型乳腺癌提供實驗室依據。