董春鳳，趙一鶴

(1.西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201)

甜龍竹(Dendrocalamusbrandisii)，別名甜竹、勃氏麻竹、勃氏甜龍竹，在云南省分布較為廣泛，主要分布在云南南部、西部，海拔600～2 000 m，廣東也有栽培[1]。甜龍竹屬禾本科(Gramineae)牡竹屬(Dendrocalamus)竹種，正常發(fā)筍期 6—10月，筍重1～3 kg左右，筍高在25～50 cm之間。由于甜龍竹竹叢緊密高大、葉片翠綠寬大，又具有一定的觀賞價(jià)值，是亞熱帶地區(qū)一種極為重要的經(jīng)濟(jì)竹種，且筍可鮮食，是我國重要和優(yōu)良的筍材兼用竹，在我國西雙版納、普洱等地及東南亞國家廣受歡迎[2-3]。甜龍竹多栽種于偏遠(yuǎn)山區(qū)，交通不便，竹筍采后運(yùn)輸距離和時(shí)間長，導(dǎo)致竹筍木質(zhì)化。在竹筍木質(zhì)化過程中，纖維素和木質(zhì)素的合成與沉積是竹筍木質(zhì)化的主要原因，而木質(zhì)素的合成是許多酶參與的一個(gè)復(fù)雜生理過程，木質(zhì)素生物合成途徑參與的酶主要包括苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥基化酶、肉桂酸-3-羥基化酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、阿魏酸-5-羥基化酶、對(duì)羥基苯乙烯酰輔酶A-3-脫氫酶、肉桂酰輔酶A還原酶、肉桂醇脫氫酶等[4]。研究較多的與竹筍木質(zhì)化相關(guān)的酶有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、肉桂醇脫氫酶(CAD)、超氧化物歧化酶(SOD)等。

目前，關(guān)于綠竹(Bambusaoldhami)[5-6]、雷竹(Phyllostachyspraecoxf.prevelnalis)[7-8]、毛竹(Phyllostachypubescens)[9-10]等竹筍的采后酶活性變化的研究很多，而關(guān)于甜龍竹筍的采后酶活性變化鮮見報(bào)道。本研究對(duì)甜龍竹筍在采后不同儲(chǔ)藏時(shí)間和不同儲(chǔ)藏溫度下的PAL、PPO、CAT、POD、CAD酶活性變化進(jìn)行測(cè)定，分析其變化特征，以期為下一步甜龍竹筍活體保鮮技術(shù)研究提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

本項(xiàng)研究采用新鮮甜龍竹筍，2020年8月采摘于云南省普洱市思茅區(qū)倚象鎮(zhèn)半坡村楊家寨。采集大小適中，高約30 cm左右，無病蟲害和機(jī)械損傷、生長健壯的鮮活甜龍竹筍，帶回云南省林業(yè)和草原科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室，分0 ℃、4 ℃以及常溫保存(20～25 ℃)，采取基部、中部、尖部混合取樣的方式，每隔12 h取樣1次(0.5 g)，總共7次。每次取樣重復(fù)3次，取平均值。取樣以后使用液氮速凍處理后放置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)和方法

采用植物ELISA檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)對(duì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、肉桂醇脫氫酶(CAD)進(jìn)行測(cè)定[11]。具體步驟如下：從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃冰箱。設(shè)置一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，使用吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，繼續(xù)使用吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測(cè)定各孔的OD值[12]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010和SPSS 24對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和方差分析，使用Origin 2019軟件進(jìn)行圖表繪制，所有數(shù)據(jù)均為3次生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同儲(chǔ)藏時(shí)間和溫度下酶活性的變化

2.1.1 PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性變化

采后甜龍竹筍在不同儲(chǔ)藏溫度下PAL活性隨時(shí)間的變化見圖1。由圖1可知，不同溫度儲(chǔ)藏下甜龍竹筍PAL活性總體隨著儲(chǔ)藏時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。0 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍PAL活性變化范圍是0.080～0.208 U/g，其中，在12 h檢測(cè)到最大值為0.208 U/g(P<0.05)，在72 h檢測(cè)到最小值為0.080 U/g(P<0.05)；4 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍的PAL活性先上升后下降，PAL變化范圍是0.098～0.199 U/g，在12 h檢測(cè)到最大值為0.199 U/g(P<0.05)，在72 h最小值為0.098 U/g(P<0.05)；常溫對(duì)照(20～25 ℃)儲(chǔ)藏的甜龍竹筍PAL活性呈現(xiàn)先上升再下降、再上升再下降的波動(dòng)，在12 h檢測(cè)到最大值為0.218 U/g(P<0.05)，在72 h檢測(cè)到最小值為0.095 U/g(P<0.05)，表明常溫對(duì)照組PAL活性波動(dòng)較大。而在儲(chǔ)藏時(shí)間72 h均檢測(cè)到所有儲(chǔ)藏溫度的最小值，分別為0.080、0.098和0.095 U/g。總體來看，相比0 ℃和4 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍，常溫對(duì)照組的PAL活性處在一個(gè)較高的水平，表明0 ℃和4 ℃低溫儲(chǔ)藏可以在一定程度上抑制PAL活性的急劇上升或下降。

圖1 不同貯藏溫度下甜龍竹筍PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性變化Fig.1 Changes of PAL(Phenylalanine Ammonia-lyase)activity in D.brandisii under different storage temperatures

2.1.2 PPO(多酚氧化酶)活性變化

采后甜龍竹筍在不同儲(chǔ)藏溫度下PPO活性隨時(shí)間的變化見圖2。由圖2可知，不同溫度儲(chǔ)藏的甜龍竹筍PPO活性總體隨著儲(chǔ)藏時(shí)間呈現(xiàn)波動(dòng)變化的趨勢(shì)。0 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍PPO活性變化范圍是8 179.667～19 571.333 U/g，在36 h的最大值為19 571.333 U/g(P<0.05)，在24 h最小值為8 179.667 U/g(P<0.05)；4 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍PPO活性變化范圍是9 033.000～19 488.333 U/g，在72 h最大值為19 488.333 U/g(P<0.05)，在24 h最小值為9 033.000 U/g(P<0.05)；常溫對(duì)照(20～25 ℃)儲(chǔ)藏的甜龍竹筍PPO活性在0 h到12 h波動(dòng)不大，24 h后急劇下降到最小值6 742.667 U/g(P<0.05)，之后又上升再下降，到72 h上升到最大值21 654.333 U/g(P<0.05)。

2.1.3 CAT(過氧化氫酶)活性變化

采后甜龍竹筍在不同儲(chǔ)藏溫度下CAT活性隨時(shí)間的變化見圖3。由圖3可知，不同溫度儲(chǔ)藏的甜龍竹筍CAT活性隨著儲(chǔ)藏時(shí)間呈現(xiàn)波動(dòng)變化的趨勢(shì)。0 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍CAT活性變化范圍是624.933～819.533 U/g，在48 h的最大值為819.533 U/g(P<0.05)，在12 h最小值為624.933 U/g(P>0.05)；4 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍CAT活性變化范圍是553.133～899.300 U/g，在0 h最大值為899.300 U/g(P<0.05)，在24 h最小值為553.133 U/g；剛采收后甜龍竹筍的CAT活性就到達(dá)一個(gè)較高的值，常溫對(duì)照組的甜龍竹筍的CAT活性最高，達(dá)到936.233 U/g，達(dá)到頂峰后急劇下降到最小值476.333 U/g，而后持續(xù)上升又下降。

圖3 不同貯藏溫度下甜龍竹筍CAT(過氧化氫酶)活性變化Fig.3 Changes of CAT(catalase)activity in D.brandisii

2.1.4 POD(過氧化物酶)活性變化

采后甜龍竹筍在不同儲(chǔ)藏溫度下POD活性隨時(shí)間的變化見圖4。由圖4可知，不同溫度儲(chǔ)藏的甜龍竹筍POD活性隨著儲(chǔ)藏時(shí)間呈現(xiàn)波動(dòng)變化的趨勢(shì)。0 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍POD活性變化范圍是2.671～4.686 U/g，在72 h檢測(cè)到最大值為4.686 U/g(P<0.05)，在36 h檢測(cè)到最小值為2.671 U/g(P<0.05)；4 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍POD活性變化范圍是2.561～4.067 U/g，在72 h檢測(cè)到最大值為4.067 U/g，在60 h檢測(cè)到最小值為2.561 U/g(P<0.05)；常溫對(duì)照的甜龍竹筍POD活性波動(dòng)變化到48 h達(dá)到最高值4.445 U/g，在60 h降至最小值3.088 U/g。

圖4 不同貯藏溫度下甜龍竹筍POD(過氧化物酶)活性變化Fig.4 Changes of POD(peroxidase)activity of D.brandisii under different storage temperatures

2.1.5 CAD(肉桂醇脫氫酶)活性變化

采后甜龍竹筍在不同儲(chǔ)藏溫度下CAD活性隨時(shí)間的變化見圖5。由圖5可知，不同溫度儲(chǔ)藏的甜龍竹筍CAD活性隨著儲(chǔ)藏時(shí)間呈現(xiàn)波動(dòng)變化的趨勢(shì)。0 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍CAD活性變化范圍是5 175.667～7 870.667 U/g，在0 h檢測(cè)到最大值為7 870.667 U/g(P<0.05)，在72 h檢測(cè)到最小值為5 175.667 U/g；4 ℃儲(chǔ)藏的甜龍竹筍CAD活性變化范圍是4 520.333～7 592.000 U/g，在36 h檢測(cè)到最大值為7 592.000 U/g，在72 h檢測(cè)到最小值為4 520.333 U/g(P<0.05)。常溫對(duì)照組的甜龍竹筍CAD活性在0 h到24 h呈下降趨勢(shì)，在24 h后開始升高，到36 h達(dá)到最大值8 450.667 U/g(P<0.05)，在72 h檢測(cè)到最小值4 596 U/g。

圖5 不同貯藏溫度下甜龍竹筍CAD(肉桂醇脫氫酶)活性變化Fig.5 Changes of CAD (cinnamyl alcohol dehydrogenase)activity in D.brandisii under different storage temperatures

2.2 時(shí)間和溫度對(duì)酶活性的影響

從表1可知，5種甜龍竹筍酶活性在第一排序軸解釋量為60.37%，第二排序軸解釋量為20.60%，即前兩軸對(duì)酶活性特征解釋值為80.97%，且儲(chǔ)藏的時(shí)間-溫度對(duì)酶活性的累計(jì)解釋量達(dá)到了97.06%。表明前兩軸能較好的解釋甜龍竹酶活性與培養(yǎng)的時(shí)間-溫度關(guān)系，并且主要由第一排序軸決定。第一、第二排序軸中，時(shí)間-溫度因子與甜龍竹筍酶活性的相關(guān)系數(shù)分別為0.795 4和0.604 1，反映出甜龍竹酶活性與的時(shí)間-溫度關(guān)系密切。

表1 時(shí)間-溫度對(duì)酶活性RDA排序的特征值及累積解釋量Tab.1 The eigenvalues and cumulative interpretations of enzyme activities’ RDA sequencing by time-temperature

從培養(yǎng)的時(shí)間-溫度與酶活性的二維排序圖(圖6)可知，時(shí)間與PPO和CAT夾角較小且方向一致，說明其與兩種酶呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，表明時(shí)間對(duì)PPO和CAT的正向變化起促進(jìn)的作用；而時(shí)間與PAL夾角最大且方向相反，表明其對(duì)該種酶存在顯著負(fù)效應(yīng)。溫度與POD夾角最小且方向一致，說明溫度對(duì)POD影響最大且呈顯著正相關(guān)關(guān)系。儲(chǔ)藏的時(shí)間-溫度均對(duì)CAD無明顯的方向和夾角關(guān)系，表明時(shí)間和溫度對(duì)該酶活性的影響最小。

圖6 酶活性與時(shí)間-溫度的冗余度分析Fig.6 Redundancy analysis of enzyme activities and time-temperature

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

竹筍采后木質(zhì)化過程中，筍體內(nèi)外都發(fā)生著一系列的變化，筍殼變黃、變暗、褐化、霉變等，筍體內(nèi)營養(yǎng)成分流失、竹筍硬度增加，逐漸喪失口感和食用品質(zhì)。而竹筍木質(zhì)化過程是在一系列酶促反應(yīng)下進(jìn)行的[13]。PAL、POD、PPO、CAD、CAT在竹筍木質(zhì)化的過程中都起著重要作用。PAL、POD、PPO、CAD、CAT在竹筍木質(zhì)化的過程中都發(fā)揮著重要作用。PAL是木質(zhì)素生物合成中的關(guān)鍵酶，可以催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸[14]。PPO 是酚類物質(zhì)進(jìn)行合成的關(guān)鍵酶，它可以為木質(zhì)素合成提供前體物質(zhì)[15]。CAT作為一種活性氧清除劑，能夠清除O2-、H2O2減緩褐變[15]。POD是木質(zhì)素合成最后一步的限速酶，在木質(zhì)素生物合成中通過催化H2O2分解從而使木質(zhì)素單體能發(fā)生聚合反應(yīng)形成木質(zhì)素[16]。CAD是木質(zhì)素合成途徑中作用于木質(zhì)素合成代謝途徑的最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶[16]。本研究測(cè)定的0 ℃、4 ℃以及常溫對(duì)照(20～25 ℃)下甜龍竹筍PAL、POD、PPO、CAT、CAD的酶活性變化特征，PAL呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與許多學(xué)者研究結(jié)果一致。謝冰[17]等的研究表明，綠蘆筍采后PAL、PPO、CAD、POD 的活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，這在麻竹筍[18]、綠竹筍[6]、雷竹筍[19]的采后酶活性研究中變化趨勢(shì)也相同。周成敏等[20]研究發(fā)現(xiàn)黃甜竹筍采收后，隨著貯藏時(shí)間的增加，PAL 和 POD 活性在短時(shí)間內(nèi)快速地增加，經(jīng)過一定時(shí)間后減少。在本研究中，儲(chǔ)藏時(shí)間達(dá)到12 h后，0 ℃、4 ℃以及常溫對(duì)照的甜龍竹筍PAL活性呈現(xiàn)波動(dòng)下降的趨勢(shì)，這是由于甜龍竹筍在逆境環(huán)境壓迫下，苯丙烷類代謝被激活，導(dǎo)致 PAL酶活力上升，此時(shí)筍內(nèi)體會(huì)產(chǎn)生較多植酸、木質(zhì)素等來降低自身所受的傷害。在合成一定量的次生物質(zhì)后，它們會(huì)反饋抑制PAL酶活力，從而減少營養(yǎng)物質(zhì)的流失，并防止次生物質(zhì)過度積累對(duì)筍體產(chǎn)生毒害，延緩老化[21]。PPO活性呈現(xiàn)波動(dòng)變化趨勢(shì)，這和周琦[18]、夏海濤[22]的研究結(jié)果一致，出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因，可能是酚類物質(zhì)氧化成醌，進(jìn)行下一步聚合時(shí)消耗掉一部分底物；還有可能是褐變組織中PPO受較低的酶反應(yīng)底物與較高的產(chǎn)物所制約[23-24]。POD活性在不同溫度下都呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，常溫(對(duì)照組)POD活性總體上高于0 ℃和4 ℃，但是差別不大，這和周琦[18]、夏海濤等[25]在不同溫度貯藏雷竹筍和馬蹄筍的研究結(jié)果不一致，可能是竹筍品種、取樣時(shí)間以及溫度設(shè)置等實(shí)驗(yàn)條件的差別導(dǎo)致。CAT和CAD活性在不同溫度下呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，但常溫對(duì)照組CAT活性波動(dòng)較大，表明儲(chǔ)藏溫度對(duì)甜龍竹筍采后CAT活性存在影響，可能與甜龍竹筍受到高溫脅迫有關(guān)。常溫(對(duì)照組)CAD活性在36 h達(dá)到峰值，明顯高于0 ℃和4 ℃儲(chǔ)藏下的甜龍竹筍的CAD活性峰值，表明低溫對(duì)于甜龍竹筍采后CAD活性有一定的抑制作用，但變化呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，考慮可以設(shè)置間隔更長的時(shí)間梯度，以達(dá)到更好的觀測(cè)甜龍竹筍采后CAD活性變化規(guī)律。

3.2 結(jié)論

甜龍竹筍采后儲(chǔ)藏過程中，酶活性的異常變化會(huì)導(dǎo)致甜龍竹筍品質(zhì)的下降、營養(yǎng)成分的流失、食用率和商品率下降等問題。本次研究得知，低溫儲(chǔ)藏對(duì)甜龍竹筍的酶活性波動(dòng)起到一定的抑制作用，常溫下儲(chǔ)藏的甜龍竹筍酶活性波動(dòng)范圍大，且會(huì)急劇上升或下降。儲(chǔ)藏時(shí)間的延長對(duì)PPO和CAT的活性增加起促進(jìn)的作用，對(duì)PAL活性存在抑制作用。