謝曉陽，魏磊，王偉，景炳年，陳譚星，顏慧萍，曹力凡，常霞，高正龍

(1.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心 河南省科學院天然產(chǎn)物重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南省高新技術(shù)實業(yè)有限公司，河南 鄭州 450002)

構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)屬于?？?Moraceae)構(gòu)屬(Broussonetia)多年生喬木，又稱褚桃，是一種具有重要價值的多功能樹種[1]。構(gòu)樹葉可做蛋白飼料，樹皮是造紙的優(yōu)質(zhì)原料，根、莖、葉、果實及種子均可入藥[2]。構(gòu)樹具有分布廣和適應(yīng)性強的特性[3-4]，雌雄異株，花期4—5月，果期6—9月。嚴格異交，其有性繁殖和無性繁殖迅速，世代周期短，株型多樣，基因組緊湊，易轉(zhuǎn)化，表型性狀和遺傳多樣性豐富[5-6]。

雜交構(gòu)樹(HybridBroussonetiapapyrifera)是中國科學院植物研究所沈世華團隊研究出的無性良種組培苗，其由落葉喬木系構(gòu)樹為父本，小灌木系構(gòu)樹為母本，雜交選育獲得。歷經(jīng)十幾年潛心研究并通過示范驗證，是中國大部分地區(qū)均可種植的優(yōu)質(zhì)樹種。采用現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種技術(shù)，通過太空搭載育種，雜交選育等手段培育出了中科1號、2號、3號雜交構(gòu)樹，雜交構(gòu)樹101，雜交構(gòu)樹201等樹種。雜交構(gòu)樹具有生長速度快，當年樹高生長速度可到3～5 m；粗蛋白含量達到20%以上，飼用價值高[7]，司炳文等[8]通過在構(gòu)樹青貯飼料中添加糖蜜和酶菌復合制劑獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料。由于構(gòu)樹對生物及非生物脅迫耐受性好以及葉片吸塵吸霾強等特點，李梅如等[9]通過轉(zhuǎn)化高牛毛草中FaDREB1基因在構(gòu)樹中異位表達，從而提高構(gòu)樹抗逆性的相關(guān)轉(zhuǎn)基因研究。這些工作都是以構(gòu)樹為研究對象，目前在雜交構(gòu)樹轉(zhuǎn)基因方面的研究很少，本研究首次選取雜交構(gòu)樹為研究對象進行轉(zhuǎn)基因研究，以充分利用雜交構(gòu)樹這種經(jīng)濟樹種，因其在農(nóng)業(yè)飼料、中醫(yī)藥、造紙行業(yè)、生態(tài)修復及綠化等方面的自身優(yōu)勢，使得本研究更具有研究意義和價值。

目前雜交構(gòu)樹項目作為國家重點扶貧工程，已在國內(nèi)很多省份開展試驗，河南省蘭考縣作為國家級重點試點地區(qū)，已經(jīng)開展了相關(guān)工作，建立了試驗區(qū)和組培中心。一直以來，雜交構(gòu)樹繁育主要是扦插，而組織培養(yǎng)成活率低，使得效率低下[10-11]。本研究通過優(yōu)化組織培養(yǎng)中的消毒方法、愈傷期及壯苗期各項激素施加條件，建立組培篩選體系。

雜交構(gòu)樹作為重要經(jīng)濟樹種，應(yīng)用廣泛，尤其在生物飼料方面。為了挖掘其遺傳轉(zhuǎn)化方面的潛力和價值，以及開展相關(guān)工作研究做鋪墊，本文進行了相關(guān)研究，研究發(fā)現(xiàn)雜交構(gòu)樹的粗蛋白含量與水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等谷物相比有一定優(yōu)勢，但含量并不突出。通過文獻調(diào)研和研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿的粗蛋白含量在植物中最為突出，而蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)作為其中的模式植物，基因組小，結(jié)構(gòu)簡單，并且已經(jīng)完成測序，加之生長周期短，所以是最佳的外源轉(zhuǎn)化基因的選取材料[12]。在外源轉(zhuǎn)化基因選取上，選取調(diào)控蛋白和氨基酸含量的基因天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate Transaminase，AAT)的表達基因作為目的基因，其在高等植物中廣泛存在，主要參與調(diào)控著植物氮素的代謝。植物對氮素的吸收主要以吸收氨態(tài)氮(NH4+或NH3)為主，一部分植物還可以吸收硝態(tài)氮(NO3-)。作物種類不同，吸收氨態(tài)氮和硝態(tài)氮的比例不同。氮的運輸形式主要是有機物——氨基酸(主要是天冬氨酸，還有少量丙氨酸、蛋氨酸、緞氨酸)和酰胺(主要是天冬酰胺和谷氨酰胺)，還有少量以硝酸形式向上運輸[13]。AAT基因有多種同工酶形式，它們在植物的各個組織都有發(fā)現(xiàn)[14]，通過亞細胞定位在細胞質(zhì)、線粒體、葉綠體、核糖體和高爾基體中都有存在AAT基因的亞細胞定位，說明不同種的同工酶在植物的新陳代謝中發(fā)揮了不同的作用[15]。有研究表明，控制蛋白質(zhì)和氨基酸含量的QTL與編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的AAT基因有對應(yīng)的關(guān)系[16]。有研究報道超量表達OsAAT1基因的陽性植株的種子中的氨基酸總含量比其對應(yīng)的陰性植株的含量提高了16.1%，蛋白質(zhì)含量提高了22.2%；超量表達OsAAT2基因的陽性植株的種子中的氨基酸總含量比其對應(yīng)的陰性植株的含量提高了12.0%，蛋白質(zhì)含量提高了21.1%[17]。

本研究克隆目的基因，構(gòu)建表達載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法[18]將目的載體轉(zhuǎn)入雜交構(gòu)樹組培葉片中，優(yōu)化葉片前期消毒體系、愈傷期激素配比、抑制農(nóng)桿菌的Cef濃度，以及Hyg對重組植株的篩選濃度。首次建立以雜交構(gòu)樹葉片為研究對象的遺傳轉(zhuǎn)化組培及篩選方法，并且對轉(zhuǎn)化蒺藜苜蓿的AAT基因到雜交構(gòu)樹中，從而提高雜交構(gòu)樹的粗蛋白含量的前期轉(zhuǎn)化方法進行了研究，為接下來雜交構(gòu)樹遺傳轉(zhuǎn)化深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 雜交構(gòu)樹來源和培養(yǎng)

雜交構(gòu)樹(科構(gòu)101)，取自蘭考中科華構(gòu)生物科技有限公司。葉片組織培養(yǎng)基：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(100 mL含鹽0.442 g、蔗糖3 g、瓊脂粉0.8 g，pH 5.8)，并與多種植物生長調(diào)節(jié)劑組合使用。將各培養(yǎng)基分別用1 mol/L KOH或1 mol/L HCl調(diào)至pH 5.8，0.8%固體瓊脂，121 ℃高壓滅菌20 min。光照時間：16 h光照培養(yǎng)，8 h暗培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度：25 ℃。

1.1.2 遺傳轉(zhuǎn)化材料來源

蒺藜苜蓿(R108)材料取自中國農(nóng)科院；表達載體ps1300，內(nèi)參基因Actin2取自河南大學植物逆境生物學重點實驗室；大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞購自于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀S1000，美國伯樂；電泳系統(tǒng)MINI-PROTEAN3，美國伯樂；定量PCR儀Lightcycler 480，美國ROCHE；電泳儀JY5000，北京君意；高速離心機PICO 21，美國熱電；高速冷凍離心機5804R，德國艾本德；超低溫冰箱MDF-U5411，日本三洋；精密天平BP310S-OCE，塞多利斯；精密pH計PHS-3C，上海雷磁；高壓高溫滅菌器LDZF-75L-II，上海申安；金屬加熱器HB-031，上海申能；制冰機FM50，北京長流；恒溫振蕩器HZQ-QX，東聯(lián)電子技術(shù)；生化培養(yǎng)箱HPS-250，東聯(lián)電子技術(shù)；智能恒溫振蕩器DZP-102，東聯(lián)電子技術(shù)；紫外可見光分光光度計T10，北京普析通用儀器有限責任公司；人工氣候培養(yǎng)箱 RXZ-280B，寧波江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 遺傳轉(zhuǎn)化篩選優(yōu)化方法

(1)生物信息學分析 通過Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中的在線功能進行生物信息學分析；通過NCBI CDD 數(shù)據(jù)庫(Conserved Domain Databases)，進行保守結(jié)構(gòu)域的分析。

(2)AAT基因克隆及重組表達載體構(gòu)建AAT基因序列查詢于Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。通過ps1300表達載體設(shè)計引物兩端酶切位點。利用Primer 6.0軟件設(shè)計具有針對性的引物。引物為Sense(XbaI)GCTCTAGAATGGCCACCAACATG，Antisense(KpnI)GGGGTACCCTAAACAAGTCCAGCTG。 PCR程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 8 min；4 ℃保溫。提取蒺藜苜蓿葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板擴增CDS全長序列。用雙酶切(XbaI和KpnI)獲得目的片段。將回收產(chǎn)物與同樣酶切的ps1300質(zhì)粒在16 ℃相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞。對過夜培養(yǎng)長出的菌落做菌落PCR，將陽性菌落搖菌并做質(zhì)粒PCR，雙酶切重組質(zhì)粒進一步驗證結(jié)果。回收雙酶切得到的CDS，測序證實重組載體構(gòu)建成功。

(3)目的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌株 采用液氮凍融法[19]將目的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，-80 ℃保存。

(4)農(nóng)桿菌株侵染液制備 搖菌培養(yǎng)農(nóng)桿菌涂抹在添加有50 mg/L卡那霉素(Kan)的YEB培養(yǎng)基上，并挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)中，28～30 ℃震蕩培養(yǎng)。將1 mL過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)接到添加有50 mg/L Kan，20 mg/L過濾滅菌的乙酰丁香酮(AS)的25 mL LB液體培養(yǎng)基中。檢測過夜培養(yǎng)的菌液OD600的值。25 ℃，5 000 rpm，15 min集菌，用MS重懸液重懸菌體，使得最終OD600的0.4～0.6。輕柔地加入20 mg/L過濾滅菌的AS混勻，為雜交構(gòu)樹葉片的侵染做準備。

(5)農(nóng)桿菌侵染雜交構(gòu)樹葉片及共培養(yǎng) 取用壯苗的葉片植株葉片切成0.5 cm×0.5 cm(作為葉片外植體)，接種于20 mL含有農(nóng)桿菌菌懸液，并添加20 mg/L AS的MS培養(yǎng)基中，28 ℃，處理50 min。隨后，將葉片外植體貼敷于無菌濾紙上，除去大部分液體培養(yǎng)基，移入添加20 mg/L AS的MS固體(0.8% w/v)培養(yǎng)基共培養(yǎng)。24 h后，用含有Cef的無菌水快速沖洗外植體，抑制農(nóng)桿菌細胞生長。無菌濾紙吸掉多余水分備用。

(6)Cef對農(nóng)桿菌的抑制效果 以0.8% MS的固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同濃度的Cef：0、100、200、300、400 mg/L；共5個水平。將共培養(yǎng)后的植株葉片接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個水平10瓶，每瓶4片葉片。光照培養(yǎng)7 d，觀察并記錄Cef對農(nóng)桿菌的抑制情況。

(7)Hyg對重組植株的篩選 由于表達載體帶有Hyg抗性，所以通過Hyg進行重組篩選。以0.8% MS的固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加優(yōu)化后的激素濃度配比和Cef濃度，再加入不同濃度的Hyg：0、2.5、5、7.5、10、20 mg/L，共6個水平。將共培養(yǎng)后的植株葉片接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個水平10瓶，每瓶4片葉片。進行耐Hyg的重組植株的篩選。觀察并記錄重組植株的生長情況。

(8)通過RT-PCR對雜交構(gòu)樹重組植株進行測定 提取雜交構(gòu)樹重組植株葉片以及未轉(zhuǎn)化的雜交構(gòu)樹葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以AAT基因為模板，通過Primer 6設(shè)計RT-PCR引物:Sense:5′-TATAACCGATCAAGCAACC-3′； Antisense:5′-CATTAATCCCAGCCTGAG-3′。

選取Actin2為內(nèi)參基因。Sense:′-CCTCCGTCTTGACCTTGC-3′；Antisense:5′-TCCTGGACCTGCCTCATC-3′。PCR 程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。實驗重復3 次，用以驗證雜交構(gòu)樹重組植株。

(9)通過熒光定量PCR對雜交構(gòu)樹重組植株AAT基因表達量進行測定 提取雜交構(gòu)樹重組植株葉片以及未轉(zhuǎn)化的雜交構(gòu)樹葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以AAT基因為模板，通過Primer 6設(shè)計RT-PCR引物:Sense:5′-CTCAAACCATGGCTTACACAAA-3′； Antisense:5′-GACAAGCAAGCAACAGTGAATA-3′。

選取Actin2為內(nèi)參基因。Sense:5′-CCTCCGTCTTGACCTTGC-3′ ；Antisense:5'-TCCTGGACCTGCCTCATC-3′。PCR 程序為：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；4 ℃ 終止反應(yīng)。實驗重復3 次，用以驗證反應(yīng)結(jié)果。

1.3.2 激素配比及消毒優(yōu)化方法

(1)雜交構(gòu)樹試驗材料消毒 選取生長健康，無病害的雜交構(gòu)樹葉片，預處理(洗潔精泡洗，自來水沖洗30 min，75%乙醇消毒20 s，無菌水沖洗2～3次，濾紙吸干)。然后放入消毒液中消毒，設(shè)置滅菌的雙蒸水(ddH2O)為空白對照。消毒液分別為： 5% NaClO、0.3% HgCl2、10% H2O2,消毒時間分別為5、10、15 min。而后用無菌ddH2O沖洗5～6次，無菌濾紙吸干，接入0.8% MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶接種4個，每組做10瓶。光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)7 d，記錄污染率、死亡率、成活率。

(2)愈傷組織及叢苗的誘導和篩選 以0.8% MS的固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同濃度的6-BA：1、1.5、2、2.5 mg/L；NAA：0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L各4個水平。將消毒后的植株葉片切成0.5 cm×0.5 cm接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個水平10瓶，每瓶4片葉片。在黑暗中放置25 d，觀察并記錄愈傷組織及叢苗的生長情況。

(3)壯苗培養(yǎng)基的篩選 以0.8% MS的固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同濃度的6-BA：1.5、2、2.5 mg/L；NAA：0.1、0.15、0.2 mg/L各3個水平。將消毒后的植株葉片切成0.5 cm×0.5 cm接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個水平10瓶，每瓶4片葉片。光照培養(yǎng)30 d，觀察并記錄壯苗期的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 AAT基因的生物信息學分析

AAT基因位于蒺藜苜蓿第七條染色體上，表達分析表明，該基因主要在葉片、根節(jié)、根中表達，其中根、葉中的表達較為豐富。作為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，該基因參與到NH4+代謝通路中，調(diào)控蛋白和氨基酸含量[20]。圖1-A為蛋白功能域，蛋白序列全長473 aa，黃色區(qū)為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶表達區(qū)。圖1-B為基因組序列，CDS全長1 422 bp，粉色區(qū)域為編碼區(qū)。圖1-C發(fā)現(xiàn)本研究克隆的基因編碼的蛋白是天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族成員，該基因編碼的蛋白具有一個天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族保守區(qū)(PRK05764)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族保守結(jié)構(gòu)域(AAT-I superfamily)。圖1-D蒺藜苜蓿中該基因序列與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、衣藻科(Chlamydomonas)相比較，同源率高達85%以上。

圖1 AAT的基因及蛋白分析注：A為蛋白功能域，B為基因組序列，C為保守序列預測，D為基因組序列同源對比。Fig.1 Analysis of AAT

2.2 AAT::ps1300重組載體驗證

根據(jù)特異引物擴增出1 422 bp目的條帶，構(gòu)建出AAT::ps1300重組載體后，通過XbaI,KpnI雙酶切，以及提質(zhì)粒進行質(zhì)粒PCR驗證，并通過測序得到目的基因CDS。證實重組載體構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 AAT::ps1300重組載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of AAT::ps1300 vector

2.3 不同消毒方法之間的對比

通過不同消毒方法7 d后處理可以看出(表1)，消毒效果最理想的是75%乙醇溶液處理20 s后，再用0.3%的HgCl2處理15 min，除菌率可以達到71.5%，植株外植體的成活率可以達到47.3%。

表1 不同消毒方法對雜交構(gòu)樹葉片消毒效果的比較Tab.1 Comparison of disinfection effects of different disinfection methods on leaves of hybrid B.papyrifera

2.4 愈傷組織及叢苗的誘導和篩選

雜交構(gòu)樹葉片在愈傷組織培養(yǎng)基上黑暗誘導培養(yǎng)25 d后，觀察不同的濃度激素配比中雜交構(gòu)樹葉片的出芽數(shù)和幼苗的生長情況，見表2。

表2 不同激素配比對雜交構(gòu)樹葉片愈傷組織及叢苗的誘導和篩選的比較Tab.2 Comparison of induction and screening of callus and cluster seedlings in leaves of hybrid B.papyrifera with different ratio of hormones

從表2中發(fā)現(xiàn)，在愈傷期，細胞分裂激素6-BA起到主導作用。較之NAA濃度增加，隨著6-BA的濃度增加，雜交構(gòu)樹葉片愈傷期出芽數(shù)增加明顯，而當6-BA濃度增加到3 mg/L時，出芽數(shù)和長勢都明顯變差。 從圖3中也直觀看到優(yōu)化后植株愈傷長勢好于優(yōu)化前。所以，當6-BA濃度為2.5 mg/L，NAA濃度為0.15 mg/L時，誘導出芽數(shù)效果最顯著。而當6-BA濃度為2.5 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時，誘導愈傷率效果最顯著。

圖3 愈傷期植株注：A為優(yōu)化前，B為優(yōu)化后。Fig.3 Callus plants

2.5 繼代壯苗培養(yǎng)基的篩選

雜交構(gòu)樹叢苗在壯苗培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)30 d后，觀察不同的濃度激素配比中雜交構(gòu)樹叢苗的生長情況。從表3中發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA的濃度增加，會抑制植株高度增加。 6-BA濃度為1.5 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時，植株高度達到3.8 cm，從圖4也可以看到這個結(jié)果，在這個參數(shù)下壯苗效果最明顯。

表3 不同激素比對雜交構(gòu)樹繼代壯苗的比較Tab.3 Comparison of different ratio of hormones on the subculture robusts seedlings of hybrid B.papyrifera

圖4 壯苗期植株注：A為優(yōu)化前，B為優(yōu)化后。Fig.4 Seedling stage plants

2.6 抗生素Cef對農(nóng)桿菌的抑制效果對比

雜交構(gòu)樹葉片在共培養(yǎng)后，接入帶有不同濃度Cef的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，觀察不同濃度的Cef對農(nóng)桿菌的抑制情況。從圖5中可以看出，300 mg/L的Cef可以顯著抑制農(nóng)桿菌的生長。

圖5 Cef 對農(nóng)桿菌的抑制率Fig.5 Inhibition rate of Cef on agrobacterium

2.7 抗生素Hyg對重組植株的篩選效果對比

將共培養(yǎng)后植株葉片接入不同濃度Hyg的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察不同濃度的Hyg對雜交構(gòu)樹重組植株的篩選情況。從圖6中可以看出，Hyg濃度到達10 mg/L以后就完全抑制幼苗生長，而在 7.5 mg/L的Hyg處理下植株成活率在5%左右。從圖7中可以直觀看到在通過優(yōu)化Hyg參數(shù)后，植株死亡率明顯上升，能夠有效篩選出重組的植株。

圖6 Hyg 篩選重組植株成活率Fig.6 Survival rate of recombinant plants in Hyg screening

圖7 Hyg篩選重組植株注：A為優(yōu)化前，B為優(yōu)化后。Fig.7 Recombinant plants screened by Hyg

2.8 RT-PCR檢測雜交構(gòu)樹重組植株

經(jīng)過Hyg 對雜交構(gòu)樹重組植株的有效篩選后，通過半定量的方法對篩選出的重組植株進行檢測，圖8中，重組1和重組2是要檢測的雜交構(gòu)樹重組植株，CK是未轉(zhuǎn)化的對照株，Actin2為內(nèi)參基因。通過檢測得出：重組植株里帶有AAT基因，空白對照里面沒有AAT基因，初步說明外源基因AAT轉(zhuǎn)入到雜交構(gòu)樹植株中。

圖8 RT-PCR檢測重組植株Fig.8 RT-PCR detection of reconstituted plants

2.9 熒光定量PCR對雜交構(gòu)樹重組植株AAT基因表達量進行檢測

通過半定量的方法對篩選出的重組植株進行檢測，驗證得出外源基因AAT轉(zhuǎn)入到雜交構(gòu)樹植株中。然后本實驗通過熒光定量PCR對雜交構(gòu)樹重組植株AAT基因表達量進行了檢測。通過實驗發(fā)現(xiàn)，較之未轉(zhuǎn)化的CK型，重組1型的植株AAT基因表達量有2.5倍的顯著提高(圖9)。

圖9 熒光定量PCR檢測重組植株AAT基因表達量Fig.9 Fluorescence quantitative PCR was used to detect the AAT gene expression in the recombinant plant

3 結(jié)論與討論

中科院沈世華團隊前期進行了雜交構(gòu)樹的選育后，雜交構(gòu)樹的價值越來越受到重視。雜交構(gòu)樹選育主要通過扦插，而組培效率低下，其中植物生長調(diào)節(jié)激素是植物外植體培養(yǎng)組織和器官分化的關(guān)鍵因素，調(diào)節(jié)其種類、濃度及組合將導致再生頻率變化[21-22]，所以本研究進行了葉片組培的相關(guān)優(yōu)化。

本研究前期優(yōu)化葉片消毒方法，葉片首先通過75%乙醇溶液處理后，再用0.3%的HgCl2處理15 min，通過優(yōu)化除菌率可以達到71.5%，植株外植體的成活率可以達到47.3%，比田瑞等[23]報道過的方法有所提高。而通過NaClO 以及H2O2的消毒方法一樣表現(xiàn)不明顯。在葉片組織培養(yǎng)中愈傷期激素配比優(yōu)化上，通過不同濃度的搭配發(fā)現(xiàn)，6-BA在愈傷期的激素中占主導作用。當6-BA濃度為2.5 mg/L，NAA濃度為0.15 mg/L時，誘導出芽數(shù)效果最顯著。隨著6-BA濃度提高到3 mg/L，愈傷明顯受到抑制。施和平等[24]報道了6-BA在3 mg/L以內(nèi)對黃瓜(Cucumissativus)毛狀根生長和形態(tài)起到促進生長作用。在壯苗期，6-BA濃度為1.5 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時，植株高度達到3.8 cm，壯苗效果最明顯。

Peng等[25]在構(gòu)樹遺傳轉(zhuǎn)化方面進行了研究，Li等[26-27]在構(gòu)樹抗逆方面進行了深入研究，而本文研究了外源基因轉(zhuǎn)化雜交構(gòu)樹的可行性。本研究選取雜交構(gòu)樹(科構(gòu)101)為轉(zhuǎn)化目的植株，蒺藜苜蓿(R108)為外源基因取材植株，對AAT基因進行相關(guān)生物信息學分析。AAT基因位于蒺藜苜蓿第七條染色體上，表達分析表明，該基因主要在葉片、根節(jié)、根中表達，其中根、葉中的表達較為豐富?；蚪M序列與擬南芥、水稻、衣藻科的同源率達到85%以上。通過克隆基因構(gòu)建了AAT::ps1300重組表達載體，采用Chen等[19]優(yōu)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，利用農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化雜交構(gòu)樹葉片。

本研究在重組植株篩選方面，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化葉片共培養(yǎng)后，300 mg/L的Cef可以顯著抑制農(nóng)桿菌的生長。由于表達載體具有抗Hyg的基因，試驗中通過不同濃度的Hyg處理，發(fā)現(xiàn)超過10 mg/L的Hyg就會導致幼苗死亡。而在7.5 mg/L的Hyg處理下，能夠有效控制重組植株的成活率在5%左右，從而提高篩選的效率。在驗證重組植株方面，通過RT-PCR驗證篩選重組成功的植株，并通過定量PCR發(fā)現(xiàn)重組植株比未轉(zhuǎn)化的野生植株AAT基因表達量提高2.5倍。

本研究通過整合并優(yōu)化早期報道的組培及相關(guān)轉(zhuǎn)化方法，首次建立以雜交構(gòu)樹葉片為研究對象的遺傳轉(zhuǎn)化組培及篩選方法。并對雜交構(gòu)樹的粗蛋白提高的前期轉(zhuǎn)化方法進行了研究，為接下來雜交構(gòu)樹遺傳轉(zhuǎn)化深入研究奠定基礎(chǔ)。