徐澤彪,胡珍淵,方永軍,王首杰
(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 咸陽712000;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 西安710038)
膠質(zhì)瘤具有復(fù)發(fā)率高、生存率低、侵襲性強的特點,是高度惡性的顱內(nèi)腫瘤,多數(shù)患者治療效果不佳,嚴重威脅著人們的健康[1]。因其與正常腦組織無明顯界限,且呈指狀向腦組織外破壞腦組織,常規(guī)切除術(shù)療效不佳,且高度惡性的膠質(zhì)瘤對放化療敏感性差,因此尋找新的治療靶點成為當前的研究熱點[2-3]。最近的研究表明,環(huán)狀RNA在神經(jīng)組織中含量更加豐富,其在神經(jīng)元的發(fā)育、增殖、腫瘤及其他疾病發(fā)生中扮演著重要的角色[4-5]。如在缺血性腦卒中模型中circDLGAP4作為miR-143的海綿,其表達水平的降低能抑制miR-143的功能,增加circDLGAP4的表達量可減輕腦損傷[6-8];circZNF292通過調(diào)控細胞間Wnt信號,影響細胞的增殖,進而參與影響腫瘤組織的血管生成[9-10];has-circ-0037251是由METRN基因的多個外顯子組成的環(huán)狀RNA,在膠質(zhì)瘤細胞的增殖和分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。此外,研究表明has-circ-0037251通過發(fā)揮miR-1229-3p海綿和調(diào)節(jié)mTOR的表達作用促進膠質(zhì)瘤的進展,而敲除has-circ-0037251基因則能促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡,并誘導(dǎo)G1期阻滯[11]。目前,對于has-circ-0037251在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達水平還缺乏分析,尤其針對其在臨床診治中的意義還未得到充分研究。因此本研究結(jié)合臨床隨訪數(shù)據(jù),主要探討has-circ-0037251在膠質(zhì)瘤患者中的表達水平及與患者預(yù)后、臨床病理特征的關(guān)系。
1.1 研究對象 回顧性分析2011年7月至2014年12月于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科行膠質(zhì)瘤切除術(shù)的患者56例為膠質(zhì)瘤組,其中男24例,女32例,中位年齡為51歲,以上腫瘤組織標本中WHO Ⅰ級20例,WHO Ⅱ級15例,WHO Ⅲ級8例,WHO Ⅳ級13例。標本來源于醫(yī)院日常收集的膠質(zhì)瘤組織,患者的臨床病理數(shù)據(jù)是先前對患者的定期隨訪收集獲得。對照組腦組織取自腦出血或外傷需要接受開顱手術(shù)的患者,共30例,其中男15例,女15例,中位年齡為40歲。組織標本取出后即在液氮中冷凍,后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱內(nèi)。患者病例資料完整,術(shù)前均未進行放療、化療、手術(shù),并且未進行靶向治療等其他新型治療手段。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,符合《赫爾辛基宣言》,研究對象或家屬均簽署了知情同意書。
1.2 檢測方法 將凍存的組織從-80 ℃冰箱取出,首先脫蠟處理腦組織標本,隨后加入TRIzol試劑從組織標本中提取RNA。采用紫外分光光度計測量RNA濃度,OD260/280在1.8~2.0之間為合格。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作,將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行熒光定量PCR 技術(shù)(qRT-PCR)反應(yīng),將GAPDH設(shè)為內(nèi)參,其引物序列為上游5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’,下游5’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’;人has-circ-0037251引物序列為:上游5’-CTGCTTTGGAGGTGATGGGGAC-3’,下游5’- GGGAGTCGGGGCTCTCAC -3’。采用2-△△Ct法計算has-circ-0037251的相對表達量。所有實驗重復(fù)3次。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行繪圖和統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間患者臨床病理指標的比較采用卡方檢驗;生存率分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進行Log-Rank檢驗;采用單因素和多因素Cox回歸分析法評價影響患者預(yù)后的臨床因素,主要包括年齡、性別、KPS評分、WHO分級、腫瘤大小、腫瘤分化程度,評估has-circ-0037251表達量對患者預(yù)后差異的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 膠質(zhì)瘤組織中has-circ-0037251的表達水平 qRT-PCR結(jié)果表明:與對照組相比,膠質(zhì)瘤組中的has-circ-0037251存在過表達現(xiàn)象[對照組(1.000±0.1756)與膠質(zhì)瘤組織(3.913±0.2589),P<0.05],且has-circ-0037251表達量與WHO分級呈正相關(guān)[WHO Ⅰ-Ⅱ級(2.429±0.1987)與WHO Ⅲ-Ⅳ級(4.628±0.3050),P<0.05],高水平表達has-circ-0037251的膠質(zhì)瘤具有更高的WHO分級。見圖1。
注:與對照組比較,*P<0.05;與Ⅰ-Ⅱ級比較,△P<0.05
2.2 has-circ-0037251在膠質(zhì)瘤組織中的表達與臨床病理特征的關(guān)系 計算膠質(zhì)瘤患者has-circ-0037251表達水平的平均值,以此將膠質(zhì)瘤患者分為has-circ-0037251高表達組(24例)和低表達組(32例)。通過對患者臨床病理特征的比較,發(fā)現(xiàn)has-circ-0037251的表達水平與WHO分級和KPS評分有關(guān)系(均P<0.05),而與年齡、性別、腫瘤大小等無關(guān)(均P>0.05)。見表1。
表1 has-circ-0037251表達水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系(例)
2.3 生存分析 隨訪期間,記錄患者生存情況。然后根據(jù)Kaplan-Meier法分析has-circ-0037251表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)has-circ-0037251低表達的患者生存時間更長,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0396)。因此,has-circ-0037251的表達量可作為判斷膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的生物學(xué)標志。見圖2。
圖2 高has-circ-00372517表達組和低has-circ-0037251表達組生存率比較
2.4 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后單因素和多因素分析 采用比例風(fēng)險回歸模型進行單因素和多因素分析,結(jié)果表明:WHO分級、KPS評分、has-circ-0037251表達水平與患者總生存率相關(guān),且高WHO分級、KPS評分<80、has-circ-0037251的高表達量是影響患者預(yù)后的獨立危險因素。見表2。
表2 患者臨床病理特征和has-circ-0037251表達的單因素和多因素分析表
膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)的高度惡性的腫瘤,其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力強,造成患者預(yù)后不良,術(shù)后極易復(fù)發(fā)[12-13]。近年來對膠質(zhì)瘤的研究不斷深入,但關(guān)于其基因調(diào)控、發(fā)生發(fā)展、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等復(fù)雜的分子機制尚未完全闡明,如何改善患者預(yù)后,尋求理想的特異性腫瘤標志物對膠質(zhì)瘤的診療有重要意義。
越來越多的的研究表明環(huán)狀RNA與神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系,諸多文獻報道環(huán)狀RNA參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性發(fā)展過程[14]。circ-0001730參與激活wnt/β-catenin通路,促進膠質(zhì)母細胞瘤的增殖,侵襲和遷移[15]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中has-circ-0007534通過發(fā)揮miR-761海綿的作用,調(diào)節(jié)ZIC5基因的表達,提示has-circ-0007534/miR-761/ZIC5調(diào)控環(huán)有望成為新的治療靶點。此外,表皮生長因子受體(EGFR)來源的has-circ-0080229可通過結(jié)合ANXA2等RNA結(jié)合蛋白,促進膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。然而到目前為止,有關(guān)膠質(zhì)瘤與環(huán)狀RNA的研究還不足以應(yīng)用于臨床,此領(lǐng)域有待我們進行更深層次的探索。
本研究選取了與膠質(zhì)瘤相關(guān)的一種環(huán)狀RNA——has-circ-0037251,探究其在膠質(zhì)瘤的診療、預(yù)后判斷方面的作用。研究發(fā)現(xiàn),與正常腦組織相比,膠質(zhì)瘤患者的has-circ-0037251表達水平顯著上調(diào),在探究has-circ-0037251表達水平與患者臨床病理指標相關(guān)性時發(fā)現(xiàn),WHO分期、KPS評分與has-circ-0037251的表達顯著相關(guān),這提示has-circ-0037251可能與膠質(zhì)瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),抑制has-circ-0037251表達有逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤的進展的可能,這一點在小鼠體內(nèi)已得到證實。Cao等[11]研究發(fā)現(xiàn)敲除has-circ-0037251可使腫瘤體積變小、重量減輕,延長小鼠生存期。然而,更有效、更準確、更特異的RNA干擾方法,尤其是能安全作用于人體的方案仍有待探索和研究。Kaplan-Meier法生存率分析表明,has-circ-0037251高表達組的生存時間低于低表達組,最后對患者的預(yù)后分析顯示W(wǎng)HO分級、KPS評分、has-circ-0037251表達水平是影響患者生存率的主要因素,而高WHO分級、KPS評分<80、has-circ-0037251高表達可作為膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后獨立因素。本研究結(jié)果為膠質(zhì)瘤早期診斷、治療和及早干預(yù)提供了參考依據(jù)。
綜上所述,has-circ-0037251很有希望作為膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后的生物學(xué)標志物,另外,has-circ-0037251能否在其他病理過程中起作用,能否尋找到一種有效干預(yù)RNA的手段以及has-circ-0037251能否人體內(nèi)作為治療靶點都有待于進一步的深入研究。