艾 林,高 鵬,李 愷,張若冰

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710032;2.陜西省藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安710065)

牙髓又稱牙髓蛋白復(fù)合體，是人體內(nèi)神經(jīng)支配最密集的組織之一。牙髓中的感覺神經(jīng)元對溫度、物理、化學(xué)刺激都有反應(yīng)，反饋為疼痛[1]。牙髓神經(jīng)元被各種炎癥介質(zhì)激活，包括內(nèi)源性物質(zhì)，如緩激肽和神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)，以及外源性物質(zhì)，如辣椒素等[1-2]。人類感知溫度的能力很大程度上取決于瞬時受體電位(Transient receptor potential,TRP)離子的受體，TRP通道可以被溫度和某些化學(xué)物質(zhì)激活，如辣椒素、薄荷腦、芥末油、樟腦和丁香酚等[3]。當(dāng)這些化學(xué)物質(zhì)被用于人體時，它們會引起燃燒或冰冷的感覺，激活背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元和三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中的受體，作為警告信號預(yù)防牙髓損傷。此外，炎癥介質(zhì)如緩激肽、前列腺素E2也可以調(diào)節(jié)這些受體[4]。其中TRPM8受體是冷感覺的主要分子介質(zhì)，體外研究確定TRPM8的組織分布僅限于成人DRG神經(jīng)元和三叉神經(jīng)節(jié)，尤其是小直徑C纖維神經(jīng)元，激活范圍在19～25 ℃之間[5]。本研究選取基因c-Fos及其蛋白作為脊髓和腦干神經(jīng)元對溫度反應(yīng)的活性標(biāo)志物，研究c-Fos在三叉神經(jīng)核中的表達(dá)，確定冷刺激牙髓是否會增加野生型小鼠腦干中c-Fos的表達(dá)，觀測對傷害性刺激有反應(yīng)的神經(jīng)元群的精確解剖位置，以及冷刺激牙髓炎癥的小鼠磨牙對腦中c-Fos的表達(dá)影響，使用TRPM8基因敲除小鼠研究TRPM8是否介導(dǎo)牙髓冷刺激痛，為臨床緩解牙髓炎等疼痛癥狀提供理論保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 TRPM8雜合子小鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院徐天樂教授惠贈。DMEM、DMEM/F-12、胰蛋白酶(Sigma公司，美國)；胎牛血清、膠原酶Ⅳ、DMSO(美國Hyclone公司)；Percoll分離液、TRIzol溶液、臺盼藍(lán)(Invitrogen公司，美國)；TRPM8羊抗鼠一抗(Santa Cruz公司，美國)；熒光定量RT-PCR試劑盒(深圳科潤達(dá)生物工程有限公司，中國)；BCA蛋白定量試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，中國)。超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠，中國)；電子分析天平(賽多利斯公司，德國)；CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司，中國)；熒光倒置顯微鏡、凝膠成像系統(tǒng)、顯微攝像全自動圖像分析儀(Olympus公司，日本)；核酸分析儀(Pharmercia公司，瑞典)；定量PCR儀，DNA測序儀(ABI公司，美國)；石蠟、冰凍組織切片機(jī)(Leica公司，德國)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TRPM8基因敲除小鼠的繁殖與鑒定：選取TRPM8基因雜合子(TRPM8+/-)小鼠，按照無特異病原體(SPF)級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(26 ℃，相對濕度50%～70%，明暗交替12 h/d，)進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖。本實(shí)驗(yàn)采用TRPM8+/-鼠進(jìn)行繁殖，其子代小鼠可能出現(xiàn)TRPM8+/+、TRPM8+/-、TRPM8-/-的基因型，在小鼠斷乳后，剪取小鼠尾尖1.0～1.2 cm,參照試劑盒說明書進(jìn)行小鼠基因型鑒定，分離出TRPM8-/-進(jìn)行繁殖。

1.2.2 冷刺激牙髓：通過吸入異氟醚(與氯胺酮相比不會影響腦干神經(jīng)元的放電)和腹腔注射2.5%三溴乙醇進(jìn)行麻醉。使用內(nèi)部飽和冰渣的棉花球在小鼠左上磨牙的頜面上直接涂抹，1次/2 min，在30 min內(nèi)至少重復(fù)12次。以對側(cè)同名牙作為空白對照。使用手術(shù)顯微鏡觀察冷刺激對上頜磨牙的作用。根據(jù)需要對動物進(jìn)行再麻醉，以確保它們在灌注前保持無意識。

1.2.3 組織制備：初始刺激結(jié)束2 h后，麻醉的小鼠經(jīng)心灌流20 ml 0.1 mol/L PBS以及20 ml 4%多聚甲醛。灌注后，將腦干解剖取出制備以下標(biāo)本。①冰凍切片用標(biāo)本：置于4% PFA中固定48 h，之后轉(zhuǎn)入30%蔗糖PFA中脫水，待標(biāo)本沉底后更換30%蔗糖PFA溶液；再次沉底脫水充分后，取出腦標(biāo)本用濾紙吸取表面殘留液體，置于-80 ℃超低溫冰箱中長期保存?zhèn)溆?。②石蠟切片用?biāo)本：小心剝離腦組織后置于4% PFA中固定48 h，之后轉(zhuǎn)入50%酒精中脫水30 min，后將腦組織置于70%酒精中室溫保存?zhèn)溆?。③新鮮標(biāo)本：小心剝離腦組織，于冰上分離小腦，置于EP管中保存于-80 ℃超低溫冰箱中，留待蛋白提取。

1.2.4 免疫組織化學(xué)：①石蠟標(biāo)本制備及HE染色：將標(biāo)本從70%酒精中取出，取下小腦，置于包埋框，依次將標(biāo)本脫水、透明、浸蠟處理，按冠狀面垂直于底面包埋，4 ℃冰箱中過夜。取出蠟塊。用石蠟切片機(jī)切取厚度為5 μm小腦矢狀面切片，37 ℃恒溫箱中烘干，常溫保存。標(biāo)本常規(guī)脫蠟及水化，過伊紅染色液，沖洗自然風(fēng)干后，DPX封片，標(biāo)本室溫保存，待拍照。②冰凍切片：從-80 ℃超低溫冰箱中取出標(biāo)本，去除小腦，以嗅球朝上方向包埋固定，用冰凍切片機(jī)切取40 μm大腦冠狀面切片，0.01 mol/L PBS漂洗，置于防凍液中，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。③免疫組織化學(xué)熒光染色：選取合適位置的小鼠大腦切片，0.01 mol/L PBS中漂洗3次后分別置于3% H2O2、0.3% Triton以及3% BSA溶液中，浸泡后分別漂洗3次，并置于中在37 ℃恒溫箱中孵育30 min。將標(biāo)本置于一抗中，4 ℃孵育過夜(c-Fos抗體孵育48 h)，0.01 mol/L PBS漂洗后置于二抗中，37 ℃恒溫箱中孵育2 h后用0.01 mol/L PBS漂洗3次。以AVP及GR指標(biāo)做免疫熒光染色，再次二抗孵育后，漂洗、復(fù)染、封片，-20 ℃保存待拍照。再以c-Fos及Ibal做免疫組化染色，進(jìn)行DAB顯色、漂洗、DPX封片，室溫保存待拍照。④免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)：裂解液裂解后提取小腦蛋白，吸取上清液，計算出小腦蛋白樣品的蛋白濃度。將蛋白樣品、緩沖液及裂解液混合配平煮沸變性后于-80 ℃冰箱中保存。SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，將蛋白進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜。取出膜，TBST緩沖液漂洗后于5%脫脂牛奶的搖床上室溫孵育3 h。再次使用TBST漂洗3次，將條帶加入一抗后4 ℃孵育過夜，漂洗3次后加入二抗后室溫孵育3 h。漂洗3次，每次10 min，Western曝光儀下進(jìn)行曝光。⑤細(xì)胞計數(shù)：在10倍顯微鏡下觀察載玻片，由一名獨(dú)立的觀測者比較同側(cè)(刺激)和對側(cè)(非刺激)三叉神經(jīng)核(尾狀、過渡區(qū)或間極)c-Fos免疫反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量，以及細(xì)胞是否出現(xiàn)在灰質(zhì)或白質(zhì)。

1.3 觀察項(xiàng)目 選取小腦矢狀面中間部位形態(tài)相似切片進(jìn)行免疫組化熒光染色及HE染色。蛋白印跡分析蛋白表達(dá)量為目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值之比，其結(jié)果取平均值進(jìn)行比較。比較各組小鼠同側(cè)和對側(cè)三叉神經(jīng)核內(nèi)c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采取LSD-t法,P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 尾端核c-Fos表達(dá)的差異 同側(cè)和對側(cè)尾端核c-Fos表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

2.2 間極核c-Fos表達(dá)的差異 同側(cè)間極核(平均4.56個細(xì)胞/切片)和對側(cè)間極核(平均3.42個細(xì)胞/切片)c-Fos表達(dá)比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖2)。

圖2 冷刺激對野生型小鼠間極核c-Fos表達(dá)的影響

2.3 尾端核和間極核之間過渡區(qū)c-Fos表達(dá)的差異 在位于尾端核和間極核之間的過渡區(qū)，同側(cè)(平均50個細(xì)胞/切片)的c-Fos表達(dá)顯著高于對側(cè)(平均18個細(xì)胞/切片)(P<0.05)(圖3)。免疫組織學(xué)切片顯示實(shí)驗(yàn)側(cè)c-Fos表達(dá)更強(qiáng)(圖4)。

圖3 冷刺激對野生型小鼠尾端核和間極核過渡區(qū)c-Fos表達(dá)的影響

2.4 冷刺激對TRPM8基因敲除小鼠c-Fos表達(dá)的影響 冷刺激小鼠磨牙，顯示TRPM8基因敲除小鼠與野生型小鼠出現(xiàn)相似的c-Fos表達(dá)模式，冷刺激側(cè)c-Fos表達(dá)增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

A：腦干免疫組織化學(xué)切片顯示c-Fos表達(dá)(×4);B：同側(cè)(實(shí)驗(yàn)側(cè))放大顯示穩(wěn)定的c-Fos表達(dá)(×10);C：對側(cè)(對照側(cè))放大顯示c-Fos細(xì)胞較少(×10)

野生型小鼠(WT)：在三個解剖位置，實(shí)驗(yàn)側(cè)c-Fos表達(dá)增加;TRPM8基因敲除小鼠(TRPM8)：實(shí)驗(yàn)側(cè)c-Fos表達(dá)同樣增加;野生型小鼠和TRPM8基因敲除小鼠在各個解剖位置上c-Fos表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)差異

3 討 論

瞬時受體電位通道(Transient receptor potential channels，TRPs)是一種位于細(xì)胞膜上的陽離子通道，最早在果蠅的視覺系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)[6]。根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)的同源性目前已發(fā)現(xiàn)28種TRP通道亞型,分為6個亞家族,參與多種機(jī)體調(diào)節(jié)機(jī)制及疾病病理生理過程[7]。TRP通道可以接受信使分子、化學(xué)、物理及溫度等變化的調(diào)節(jié)，是細(xì)胞重要的感受器。TRP通道家族分布廣泛[4,8],主要功能包括：溫度和疼痛感覺、機(jī)械感覺、味覺感覺、介導(dǎo)PLC依賴的鈣內(nèi)流、維持細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)、參與細(xì)胞生長調(diào)控、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放和激素分泌等。Tsavaler等[9]用人類前列腺特異性互補(bǔ)DNA(cDNA)文庫的方法分離出了一種新型的前列腺特異性基因，命名TRPM8。人類TRPM8的基因位于染色體2q37.1部位,全長102.12 kb[10]。TRPM8主要分布于前列腺、背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)的感覺神經(jīng)元，是一種非選擇性的陽離子通道，有研究表明TRPM8通道和冷覺感受器之間的溫度-反應(yīng)性曲線有一定的波動性[11]。TRPM8有通道激活的溫度閾值，溫度閾值指溫度感覺神經(jīng)元開始誘發(fā)動作電位的特定溫度，其溫度敏感性主要依賴于跨膜電壓。桉葉腦、芳樟醇、香葉醇也可以激活TRPM8產(chǎn)生涼爽的感覺[12]。因此TRPM8對于冷刺激的傳導(dǎo)起著重要作用。

牙髓中的感覺神經(jīng)元對溫度、化學(xué)、機(jī)械刺激都有反應(yīng)，就像在牙本質(zhì)過敏癥的情況下一樣。此外，牙髓神經(jīng)元也可以被各種炎癥介質(zhì)激活。牙髓的傷害感受器可分為兩類：①A-δ(有髓)纖維位于牙髓周圍，刺激閾值相對較低，并產(chǎn)生劇烈的刺痛。這些纖維占支配牙髓、牙本質(zhì)、前牙本質(zhì)和牙髓角附近成牙本質(zhì)細(xì)胞層的25%～50%。②C(無髓鞘)纖維位于牙髓深處。它們具有較高的刺激閾值，通常在組織損傷時被激活，并以隱痛為特征。刺激溫度分為無害低溫(15～30 ℃)，有害低溫(15 ℃及以下)和有害高溫(43 ℃以上)三種類型[2]。人類感知溫度的能力很大程度上取決于瞬時受體電位離子的受體。對牙髓的感覺刺激，無論是溫度、化學(xué)還是機(jī)械刺激，都反饋為疼痛。牙本質(zhì)敏感性的流體動力學(xué)理論認(rèn)為，刺激會引起牙本質(zhì)液體流動的變化，從而通過機(jī)械感受器反應(yīng)激活神經(jīng)纖維，從而引起疼痛。然而，最近研究[4，13]發(fā)現(xiàn)的TRPs是溫度刺激激活神經(jīng)末梢的另一種機(jī)制。

本研究選取的基因c-Fos及其蛋白作為脊髓和腦干神經(jīng)元對有毒化學(xué)、熱和機(jī)械刺激的反應(yīng)的活性標(biāo)志物。通?；虮磉_(dá)是用原位雜交來測量的，而蛋白質(zhì)的表達(dá)也可以用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)來評估。通過使用c-Fos，可以觀測到對傷害性刺激有反應(yīng)的神經(jīng)元群的精確解剖位置。通過計算參與刺激信號的中樞神經(jīng)系統(tǒng)解剖區(qū)域中標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量來量化蛋白表達(dá)。但將c-Fos表達(dá)量誘導(dǎo)到可靠測量的水平需要強(qiáng)烈而持久的刺激，而且并非所有的神經(jīng)元在激活時都能表達(dá)這種基因。因此，c-Fos表達(dá)的缺失不能說明對應(yīng)的神經(jīng)活動的缺失。

本研究結(jié)果表明，冷刺激實(shí)驗(yàn)小鼠正常牙髓后，過渡區(qū)神經(jīng)元中c-Fos的表達(dá)顯著增加,這一發(fā)現(xiàn)表明，有害的冷刺激會增加相關(guān)腦干神經(jīng)元的神經(jīng)活動。本研究所建立的模型可用于研究牙髓疼痛的傳導(dǎo)，使用c-Fos表達(dá)也可以作為牙髓疼痛傳導(dǎo)測量的有效工具。如前所述，誘導(dǎo)c-Fos需要強(qiáng)烈而持久的刺激。盡管我們無法精確測量冷刺激作用于小鼠磨牙的量，但本研究表明，在有害的冷刺激時，c-Fos的表達(dá)顯著增加，這表明刺激的量和時間是足夠的。本研證明c-Fos在三叉神經(jīng)核中的表達(dá)，確定冷刺激牙髓增加了野生型小鼠腦干中c-Fos的表達(dá)。

本研究顯示:TRPM8的缺失不會影響冷誘導(dǎo)c-Fos的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)表明TRPM8可能不是小鼠牙髓中負(fù)責(zé)溫度傳遞的唯一受體，還應(yīng)考慮其他冷傳導(dǎo)通道的作用，如鉀通道和鈉通道。有研究[14]證明人牙髓成纖維細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞在分子、蛋白質(zhì)和功能水平上表達(dá)TRPs，特別是TRPA1和TRPM8,結(jié)果表明成纖維細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞也可能在調(diào)節(jié)人類牙齒的冷刺激反應(yīng)中起作用，本研究為臨床緩解牙髓炎等疼痛癥狀提供理論支持。