閆建華，許曉玲，李荷蓮，王高偉

黃河三門峽醫(yī)院，河南三門峽472000

世界老年人口增長迅速，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，到2050年，世界60歲以上的老年人口將占總?cè)丝诘?2%［1］。隨著年齡增加或衰老進(jìn)程加快，衰老相關(guān)性疾病的發(fā)病率迅速增長。衰老是指人體細(xì)胞及組織在結(jié)構(gòu)和機(jī)能上所出現(xiàn)的退行性變化現(xiàn)象，是生物生命過程中的必然規(guī)律［2-3］。其主要表現(xiàn)為器官質(zhì)量減輕，細(xì)胞萎縮，胞質(zhì)色素沉著，功能代謝降低，適應(yīng)能力減弱，抗病能力低下等，所帶來的醫(yī)療負(fù)擔(dān)也日益加重［4-5］。現(xiàn)階段國內(nèi)外科研工作者對抗衰老和具有抗衰老活性的天然產(chǎn)物的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，仍需積極探索和開發(fā)［6］。衰老的研究已經(jīng)成為當(dāng)今的一個研究熱點(diǎn)及難點(diǎn)［7］。黃酮類化合物是一類在多種天然植物中廣泛存在的酚類化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗癌和調(diào)節(jié)血管滲透等藥理作用［8-9］。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃酮類化合物通過清除過多的自由基，減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)衰老機(jī)體腦、肝、睪丸和皮膚等組織，與自由基學(xué)說密切相關(guān)［10-11］。鐵皮石斛為蘭科石斛屬多年生附生草本植物［12］，其具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳等功能，有免疫、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗菌等作用［13］。鐵皮石斛研究多聚集于多糖及堿類化合物，對酚類中的黃酮化合物研究甚少。有研究顯示，霍山石斛多糖可改善衰老模型大鼠小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，并對消化酶活性和營養(yǎng)素吸收產(chǎn)生有益影響［14］。本研究選取鐵皮石斛總黃酮為研究對象，基于黃酮類化合物藥理作用，觀察鐵皮石斛總黃酮對D-半乳糖所致小鼠衰老模型的影響，為臨床防治衰老疾病提供實(shí)驗支撐。

1 材料

1.1 動物昆明（KM）小鼠50只，SPF級，雄性，4～5周齡，體質(zhì)量18～22 g，濟(jì)南朋悅實(shí)驗動物繁育有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20190003，溫度25℃，濕度45%～75%飼養(yǎng)室。

1.2 藥物與試劑鐵皮石斛總黃酮，寶雞晨光生物科技有限公司，含量：50.07%（即每100 g藥材含TFHM生藥量50.07 g）；抗壞血酸（輝瑞制藥有限公司，批號：20180513）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號：E20180708A）；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號：E201801015A）；丙二醛（monochrome display adapter，MDA）試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號：E20181013A）；過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號：E20181022A）；ATP酶試劑盒及羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號：E20181025AE20181014A）；脂褐素（lipofuscin，LF）試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號：E20181102A）；Ⅰ型膠原蛋白試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號：E20181110A）；Ⅲ型膠原蛋白試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號：E20181108A）。

1.3 儀器TGL-16型高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀）；PT-3502型酶標(biāo)儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制及給藥小鼠于實(shí)驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)挑選10只為空白組，其余小鼠選取狀態(tài)良好的依次分為模型組，抗壞血酸（100 mg·kg-1）組，鐵皮石斛總黃酮高、低劑量組（400 mg·kg-1、200 mg·kg-1），每組10只。空白組除外，其余小鼠頸背部注射5%的D-半乳糖（400 mg·kg-1），空白組頸背部注射同體積生理鹽水，空白組及模型組給予同等體積生理鹽水灌胃，每天注射及灌胃給藥1次，連續(xù)6周。每兩周稱小鼠體質(zhì)量并變換劑量。末次給藥2 h后，小鼠腹主動脈取血檢測相關(guān)指標(biāo)［15-16］。

2.2 指標(biāo)檢測

2.2.1 血清指標(biāo)10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離血清，用ELISA法檢測血清SOD、T-AOC活性及MDA含量。

2.2.2 皮膚組織檢測小鼠背部皮膚脫毛，取1.5 cm×1.5 cm背部皮膚，剪去皮下組織稱質(zhì)量，用0.9%NaCl溶液中漂洗，吸水紙拭干，剪碎，加入預(yù)冷的0.9%NaCl溶液（0.9%NaCl溶液的體積總量是皮膚質(zhì)量的9倍）和適量蛋白裂解液，用組織勻漿機(jī)勻漿，ELISA法檢測皮膚組織中CAT、SOD、ATP酶活性及LE、HYP、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白含量。

2.2.3 臟器指數(shù)將胸腺、脾臟、肝臟和腎臟組織于4℃生理鹽水中清洗，濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，計算器官指數(shù)。

器官指數(shù)＝器官質(zhì)量／小鼠體質(zhì)量

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，運(yùn)用單因素方差對各組間對比，依照方差齊性進(jìn)行LSD法及Games-Howell法選擇，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對小鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA含量的影響與空白組比較，模型組小鼠血清中SOD、T-AOC活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，鐵皮石斛總黃酮各劑量組及抗血酸組均可不同程度升高模型小鼠血清中SOD、T-AOC活性，降低MDA含量（P＜0.05；P＜0.01）。見表1。

3.2 對小鼠皮膚組織SOD、CAT、ATP活性及HYP含量的影響與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織中SOD、ATP活性顯著降低，CAT活性顯著升高，HYP含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，鐵皮石斛總黃酮各劑量組及抗血酸組均可顯著升高模型小鼠皮膚組織中SOD、ATP活性，顯著降低CAT活性，顯著升高HYP含量（P＜0.05；P＜0.01）。見表2。

表1 對小鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA影響（±s）

表1 對小鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA影響（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別n劑量／mg·kg-1 SOD／U·mL-1 MDA（c／μmol·L-1）T-AOC／U·mL-1空白組10-272.59±35.61**6.42±0.88**28.42±3.18**模型組10-188.68±26.27△△25.54±3.52△△19.04±3.20△△抗血酸組10 100 260.47±36.81**17.35±3.15**23.87±3.63**鐵皮石斛總黃酮高劑量組 10 400 253.76±35.84**18.07±3.09**22.98±3.18**鐵皮石斛總黃酮低劑量組 10 200 230.7±33.26**18.46±3.33**21.59±3.32*

表2 對小鼠皮膚SOD、CAT、ATP活性及HYP含量影響（±s）

表2 對小鼠皮膚SOD、CAT、ATP活性及HYP含量影響（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別n劑量／mg·kg-1 SOD／U·mg-1 pro CAT／U·mg-1 pro ATP／nmol·mg-1 prot HYP／mg·g-1空白組10-54.74±7.12**152.00±9.04**23.01±1.63**0.26±0.04**模型組10-26.69±4.32△△280.99±23.16△△14.58±1.06△△0.17±0.03△△抗血酸組10 100 50.74±4.48**201.84±13.01**20.18±1.46**0.45±0.09**鐵皮石斛總黃酮高劑量組 10 400 48.42±5.81**230.70±15.06**19.23±1.24**0.41±0.08**鐵皮石斛總黃酮低劑量組 10 200 42.45±4.89**257.53±16.26*17.76±1.87**0.31±0.05**

3.3 對小鼠皮膚組織Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、LF含量的影響與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白含量顯著降低，LF含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，鐵皮石斛總黃酮各劑量組及抗血酸組均可顯著升高模型小鼠皮膚組織中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白含量，降低LF含量（P＜0.05；P＜0.01）；鐵皮石斛總黃酮低劑量組雖可升高模型小鼠皮膚組織中Ⅲ型膠原蛋白含量，但統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 對小鼠皮膚組織Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、LF含量影響（±s）

表3 對小鼠皮膚組織Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、LF含量影響（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別n劑量／mg·kg-1Ⅰ型膠原蛋白／ng·g-1Ⅲ型膠原蛋白／ng·g-1 LF／pg·L-1空白組10-554.38±32.01**108.09±10.31**2.62±0.19**模型組10-384.66±26.78△△68.73±8.14△△7.59±0.56△△抗血酸組10 100 504.38±34.54**98.53±6.11**3.00±0.28**鐵皮石斛總黃酮高劑量組10 400 497.28±26.97**92.49±7.65**3.54±0.42**鐵皮石斛總黃酮低劑量組10 200 417.38±34.58*75.10±5.29 4.13±0.53**

3.4 對小鼠胸腺、脾臟、肝臟、腎臟臟器指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠胸腺、脾臟、腎臟臟器指數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢，肝臟臟器指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，鐵皮石斛總黃酮各劑量組及抗血酸組均可不同程度升高模型小鼠胸腺、脾臟、腎臟臟器指數(shù)，肝臟臟器指數(shù)降低（P＜0.05；P＜0.01）；鐵皮石斛總黃酮低劑量雖可升高模型小鼠腎臟指數(shù)，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 對小鼠胸腺、脾臟、肝臟、腎臟臟器指數(shù)影響（±s）

表4 對小鼠胸腺、脾臟、肝臟、腎臟臟器指數(shù)影響（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別n劑量／mg·kg-1胸腺／mg·g-1脾臟／mg·g-1肝臟／mg·g-1腎臟／mg·g-1空白組10-2.51±0.28**3.06±0.28**39.18±4.58**21.01±1.82**模型組10-1.56±0.24△△1.98±0.28△△58.24±6.79△△15.21±0.49△△抗血酸組10 100 2.32±0.31**2.75±0.28**45.56±6.03**20.61±1.57**鐵皮石斛總黃酮高劑量組 10 400 2.07±0.25**2.47±0.33**47.33±5.90**18.04±1.64**鐵皮石斛總黃酮低劑量組 10 200 1.91±0.25**2.35±0.34*42.52±5.59**16.84±2.11

4 討論

皮膚老化主要由內(nèi)源性生理因素及外源性生理因素造成，現(xiàn)階段對皮膚衰老的研究多通過建立相應(yīng)動物模型，尤其是研究小鼠老化模型［17］。亞急性衰老模型和光老化模型是目前常見的老化模型。D-半乳糖所致皮膚衰老屬于亞急性衰老模型，正常機(jī)體代謝中D-半乳糖可轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟牵瑓⑴c葡萄糖代謝過程［18］。當(dāng)機(jī)體過量攝入后導(dǎo)致代謝紊亂，使各器官氧化酶活性改變，形成更多超氧陰離子及各種氧化產(chǎn)物等，引起細(xì)胞損害，以致機(jī)體多器官、多系統(tǒng)功能減退，最終導(dǎo)致衰老。此模型建模時間短，成模率高，模型穩(wěn)定，部分指標(biāo)與自然衰老類似，因此得到廣泛應(yīng)用［19-20］。

研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物通過清除過多的自由基，減緩氧化應(yīng)激，保護(hù)衰老機(jī)體腦、肝、睪丸和皮膚等，如淫羊藿總黃酮、柿葉黃酮、苦參總黃酮、大豆黃酮、草豆蔻總黃酮、苦丁茶黃酮等［21-22］。針對皮膚衰老的防治主要涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、膠原修復(fù)、炎癥反應(yīng)及免疫抑制等。衰老患者機(jī)體內(nèi)自由基增多，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)SOD含量降低，MDA含量升高，T-AOC能力降低［23-24］。CAT是催化過氧化氫分解成氧和水的酶，存在于細(xì)胞的過氧化物體內(nèi)，含量增加或減少可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［25］。ATP酶存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，在物質(zhì)運(yùn)送能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞方面具有重要作用，是體現(xiàn)機(jī)體抗氧化能力的重要活性酶之一。LF是溶酶體作用機(jī)體細(xì)胞后不能被消化的物質(zhì)而形成的殘余體，沉積于淺表皮膚者就是人們俗稱的“老年斑”，其積累隨年齡的增長而增多，是評價衰老的重要指征之一［26-27］。本研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛總黃酮可有效調(diào)節(jié)模型小鼠體內(nèi)SOD、T-AOC、ATP活性，降低CAT活性及MDA含量，提示抗衰老機(jī)制與降低氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。Hyp是膠原蛋白中最重要、含量最多、且最穩(wěn)定的氨基酸，其作為間接反映膠原纖維總量的指標(biāo)來衡量真皮衰老的程度［28］。膠原纖維是真皮的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，占皮膚干質(zhì)量的80%。人真皮中的膠原主要由Ⅰ型膠原（80%）和少量Ⅲ型膠原（10%）組成，皮膚質(zhì)地主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的比例決定，兩者比例失調(diào)將引起皮膚質(zhì)量發(fā)生變化［29］。衰老患者皮膚中所含的膠原纖維會逐漸降解，從而損害了真皮結(jié)構(gòu)的完整性。HYP活性降低，HYP合成減少，體內(nèi)膠原蛋白合成也隨之降低，因而HYP的含量可反映體內(nèi)膠原的含量［30］。結(jié)果顯示，鐵皮石斛總黃酮可有效升高機(jī)體內(nèi)HYP、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白含量，可知抗衰老機(jī)制可能與促進(jìn)機(jī)體內(nèi)膠原修復(fù)有關(guān)。

本研究可知鐵皮石斛總黃酮對皮膚衰老小鼠具有一定干預(yù)作用，后期需進(jìn)一步深入分子通路方面，明確鐵皮石斛總黃酮具體抗病機(jī)制，為臨床防治皮膚衰老提供實(shí)驗依據(jù)［31］。