孫艷華，徐建立，李明，曹學彬，董路，孟小晶

1.滄州市人民醫(yī)院，河北滄州061000；2.滄縣醫(yī)院，河北滄縣061009

大腸癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率仍呈逐年增長趨勢，嚴重威脅著人們的生命健康。近年來，雖然手術(shù)技術(shù)及化療方案取得了很大進步，但大腸癌患者術(shù)后復發(fā)率達40% ～50%，5年生存率仍不足40%［1-3］。而化療耐藥所致化療敏感性降低是導致大腸癌患者復發(fā)的主要因素之一［4-6］。因此，尋找高效化療增敏劑或許是解決化療耐藥、延長大腸癌患者生命的有效手段。紫草是我國傳統(tǒng)中藥品種，《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》中均有記載，具有清熱涼血，解毒透疹之功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，紫草素具有明顯的抗腫瘤活性，對肺癌［7］、肝癌［8］、宮頸癌［9］、子宮內(nèi)膜癌［10］、乳腺癌［11］等均具有一定的抑制作用，且能提高肺癌H1975細胞對埃克替尼［12］和絨毛膜癌細胞對甲氨蝶呤［13］的化療敏感性。本研究通過紫草素＋奧沙利鉑聯(lián)合干預人大腸癌HT29細胞，并對比奧沙利鉑組、空白對照組療效，研究紫草素對人大腸癌HT29細胞奧沙利鉑化療敏感性的作用及其機制。

1 材料

1.1 細胞人大腸癌HT29細胞（中科院上海細胞庫）。

1.2 藥品與試劑紫草素（中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%，批號：110769-201904）；注射用奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：1812016）；DMEM培養(yǎng)基（高糖）、胰蛋白酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：20190419、20190403）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：190527）；CCK-8試劑盒（南京立喬生物科技有限公司，批號：190318）；Annexin-PE／7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號：556418）；Bcl-2抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：201901004）；Bax抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：201811012）；激活型Caspsae-3多克隆抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：201812009）。

1.3 儀器EPICS-XL型流式細胞儀（美國Bcekman公司）；iMark型酶標儀（美國BIO-RAD公司）；BB5060U型CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Hereaus公司）；DYY-11型多用電泳儀、DYCZ-40B型轉(zhuǎn)印泳槽（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 細胞分組與給藥人大腸癌HT29細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置恒溫37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HT29細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度至5×104mL-1，設空白對照組、紫草素（0.5 mg·L-1）組、奧沙利鉑（25 mg·L-1）組［14］、聯(lián)合［紫草素（0.5 mg· L-1）＋奧沙利鉑（25 mg·L-1）］組，每組設10個復孔，給藥干預48 h后進行指標檢測。

2.2 指標的檢測

2.2.1 細胞增值率的測定采用細胞活力檢測試劑盒（CCK-8）測定細胞增值率：調(diào)整細胞濃度至3×103mL-1接種于96孔板（接種量50μL），每組10個復孔，每孔加入10μL的CCK-8溶液，置細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后，通過酶標儀測定A570 nm值。

細胞增殖率（%）＝［（空白對照組A570 nm值-干預組A570 nm 值）／空白對照組A570 nm值］×100%

2.2.2 細胞凋亡及細胞周期的檢測各組分別取約1×106個細胞，經(jīng)離心半徑10 cm、10 000 rpm離心5 min后去上清、取沉淀細胞，經(jīng)PBS溶液洗滌后加入5 mL濃度70%乙醇，恒溫4℃放置48 h后再次離心取細胞，經(jīng)PBS溶液洗滌后加入5μL濃度為10 g·L-1的水解酶Rnase，恒溫37℃放置1 h后加入碘化丙啶染液行避光孵育0.5 h，然后經(jīng)流式細胞儀檢測并分析細胞周期時相；遵照Annexin-PE／7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒操作說明，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡狀況并計算凋亡率。

2.2.3 Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達檢測取各組細胞經(jīng)半徑10 cm、10 000 r·min-1離心5 min后取細胞，行3次PBS溶液洗滌后超聲破碎細胞，恒低溫4℃條件下高速12 000 r·min-1離心20 min取沉淀，BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒進行蛋白定量后，行水沸浴高溫變性，然后采用Western blot法進行蛋白表達檢測：上樣、SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、麗春紅染色、5%脫脂奶粉封閉后，恒溫4℃環(huán)境一抗（Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3、β-actin）孵育12 h，PBS溶液洗膜后二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，以β-actin為內(nèi)參，條帶灰度值以半定量蛋白表達。

2.3 統(tǒng)計學方法計量結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）方式表示，多組間均數(shù)比較通過SPSS 17.0軟件行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，取檢測限α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組人大腸癌HT29細胞增殖檢測結(jié)果較空白對照組，紫草素組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組人大腸癌HT29細胞增殖率顯著降低（P＜0.01）；較奧沙利鉑組，聯(lián)合組HT29細胞增殖率明顯降低（P＜0.05）。見表1。

3.2 各組人大腸癌HT29細胞凋亡檢測結(jié)果較空白對照組，紫草素組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組HT29細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；較奧沙利鉑組，聯(lián)合組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。見表1，圖1。

表1 各組人大腸癌HT29細胞增殖率和凋亡率（±s，%）

表1 各組人大腸癌HT29細胞增殖率和凋亡率（±s，%）

注：較空白對照組，*P＜0.05，**P＜0.01；較奧沙利鉑組，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別n 細胞增殖率細胞凋亡率空白對照組10-1.80±0.45紫草素組10 22.05±3.48**16.72±1.79**奧沙利鉑組10 17.93±2.27**21.38±2.43**聯(lián)合組10 14.48±1.71**△27.42±3.85**△△

圖1 各組人大腸癌HT29細胞凋亡情況

3.3 各組人大腸癌HT29細胞周期檢測結(jié)果較空白對照組，紫草素組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組處于細胞周期G0／G1期細胞比例顯著升高，S期、G2／M期細胞比例顯著降低（P＜0.05；P＜0.01）；較奧沙利鉑組，聯(lián)合組G0／G1期細胞比例顯著升高，G2／M期細胞比例顯著降低（P＜0.05；P＜0.01），S期細胞比例兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖2，表2。

圖2 各組人大腸癌HT29細胞周期分布

表2 各組人大腸癌HT29細胞周期（±s，%）

表2 各組人大腸癌HT29細胞周期（±s，%）

注：較空白對照組，*P＜0.05，**P＜0.01；較奧沙利鉑組，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別n細胞周期G0／G1期S期G2／M期空白對照組3 37.01±3.38 42.79±3.61 20.20±1.98紫草素組3 44.32±5.11**38.24±2.83**17.44±1.76**奧沙利鉑組3 42.10±5.34*39.81±2.76*18.09±1.62*聯(lián)合組3 48.69±6.22**△ 37.30±2.48**14.01±1.43**△△

3.4 各組人大腸癌HT29細胞Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達檢測結(jié)果較空白對照組，紫草素組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組HT29細胞Bcl-2蛋白表達量顯著降低而Bax、激活型Caspase-3蛋白表達量顯著升高（P＜0.05；P＜0.01），Bax／Bcl-2值顯著升高（P＜0.01）；較奧沙利鉑組，聯(lián)合組Bcl-2表達量顯著降低而Bax、激活型Caspase-3表達量顯著升高（P＜0.05；P＜0.01），Bax／Bcl-2值顯著升高（P＜0.01）。見表3、圖3。

表3 各組人大腸癌HT29細胞Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達及Bax／Bcl-2值（±s）

表3 各組人大腸癌HT29細胞Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達及Bax／Bcl-2值（±s）

注：較空白對照組，*P＜0.05，**P＜0.01；較奧沙利鉑組，△P＜0.05，△△P＜0.01

-actin空白對照組3 1.47±0.25 0.53±0.11 0.36±0.09 0.07±組別n Bcl-2／β-actin Bax／β-actin Bax／Bcl-2 激活型Caspase-3／β 0.03 紫草素組3 1.24±0.21*0.92±0.14**0.73±0.14**0.30±0.08**奧沙利鉑組3 1.06±0.17**1.14±0.28**1.08±0.21**0.27±0.07**聯(lián)合組3 0.64±0.12**△△1.51±0.27**△2.37±0.45**△△0.39±0.11**△△

圖3 各組人大腸癌HT29細胞Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達

4 討論

目前，臨床上對于大腸癌的治療主要采取外科手術(shù)切除結(jié)合術(shù)前、術(shù)后化療的治療方案，能相對延長患者生存期，但仍無法控制大腸癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。奧沙利鉑是大腸癌化療一線用藥，耐藥所致化療敏感性的降低是導致其術(shù)后復發(fā)的主要原因之一，因此，研發(fā)高效的化療增敏劑或許能夠提高其療效和預后。

紫草素是中藥紫草的主要活性成分，近年來，紫草素抗腫瘤活性逐漸得到證實。楊陽等［9］研究發(fā)現(xiàn)紫草素能夠通過改變細胞周期而對宮頸癌SiHa細胞生長起到抑制作用；張萍等［15］發(fā)現(xiàn)紫草素能夠通過調(diào)節(jié)凋亡相關基因（上調(diào)促凋亡基因Bax，下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2表達），促進人肝癌HepG2細胞凋亡，進而抑制其生長。紫草素的化療增敏作用也得到了廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能夠逆轉(zhuǎn)人肺腺癌A549細胞［16］和卵巢癌SKOV3細胞［17］順鉑耐藥并提高其化療敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，與奧沙利鉑單藥組比較，紫草素＋奧沙利鉑聯(lián)合給藥干預能夠更加明顯地阻滯人大腸癌HT29細胞周期、抑制HT29細胞增殖并提高其凋亡率，提示紫草素具有提高人大腸癌HT29細胞奧沙利鉑化療敏感性的作用。

抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡是奧沙利鉑抗腫瘤最主要的作用機制［18-19］。激活型Caspase-3參與細胞凋亡全過程調(diào)控，是誘導細胞凋亡最關鍵的蛋白酶［20-22］，Bcl-2和Bax同屬Bcl-2基因家族，二者相互作用而發(fā)揮對細胞凋亡的調(diào)控作用。Bcl-2能夠抑制Caspase-3蛋白酶的激活、抑制Ca2＋內(nèi)流超載，表現(xiàn)為抑凋亡作用［23-25］；而Bax則能夠促進細胞色素釋放、破壞線粒體膜通透性等而表現(xiàn)出促凋亡作用［26-27］；且Bcl-2、Bax二者對凋亡的調(diào)控作用正向依賴于比值［28-30］。本研究發(fā)現(xiàn)，與奧沙利鉑單藥組比較，紫草素＋奧沙利鉑聯(lián)合給藥干預能夠顯著提高人大腸癌HT29細胞Bax、激活型Caspase-3蛋白表達并降低Bcl-2表達，提高Bax／Bcl-2值；與空白對照組比較，紫草素單藥干預能夠顯著提高Bax、激活型Caspase-3蛋白表達并降低Bcl-2蛋白表達，提高Bax／Bcl-2值，這可能是紫草素增強奧沙利鉑促進人大腸癌HT29細胞凋亡的重要分子機制。

綜上所述，紫草素具有提高人大腸癌HT29細胞奧沙利鉑化療敏感性的藥理學作用，其作用機制可能與紫草素阻滯細胞周期進程而抑制HT29細胞增殖、調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白表達而促進其凋亡有關。