謝劍琳，呂君楠，胡潔，楊曉龍

邯鄲市中心醫(yī)院，河北邯鄲056000

急性心肌梗死是指冠狀動脈狹窄所致持續(xù)性缺血缺氧而引發(fā)心肌缺血性壞死，繼而出現(xiàn)心衰、惡性心律失常甚至猝死，是臨床上較為常見的急危重癥，發(fā)病率逐年上升且呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴重威脅人類的生命健康［1-3］。其中心肌梗死急性期并發(fā)心功能急劇減退是導(dǎo)致心源性猝死的主要原因［4］。氧化應(yīng)激損傷［5-6］和炎癥級聯(lián)反應(yīng)［7-8］在急性心肌梗死病理變化過程中發(fā)揮著重要作用。熊果酸是一種存在于天然植物中的五環(huán)三萜類化合物，具有抗氧化、抗炎等生物學(xué)活性［9-11］。本研究將制備急性心肌缺血再灌注（I／R）大鼠模型并于造模前7 d給予熊果酸進行預(yù)處理，探討熊果酸預(yù)處理對急性心肌I／R損傷的保護作用及可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物健康清潔級SD大鼠120只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量（250±20）g，購自河北省實驗動物中心［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2018-004］。飼養(yǎng)于邯鄲康業(yè)制藥有限公司［動物使用許可證號：SCXK（冀）2019-003］，飼養(yǎng)條件：溫度25℃，相對濕度（60±5）%，光照黑暗各12 h交替，自由飲水進食。本實驗經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準［倫理號：HDZXLL（K）字2020-012］。

1.2 藥物與試劑熊果酸購自美國Sigma公司（純度≥98.5%，批號：89797）；鹽酸維拉帕米注射液上海禾豐制藥有限公司（批號：181016）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：201901016）；過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：201811009）；丙二醛（monochrome display adapter，MDA）試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：201903012）；硝基藍四氮唑（NBT）（上海前進試劑廠，批號：191127）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：190124）；細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：181203）；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：181130）；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：181215）。

1.3 儀器DW-2000型動物呼吸機（上海嘉鵬技術(shù)有限公司）；RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司）；DU700型紫外-可見分光光度計（美國Beckman Coulter公司）；SpectraMax M3型多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）；BL-A420型動物心電圖機（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 模型制備與給藥將120只大鼠進行編號后按照隨機數(shù)字表法進行分組。設(shè)假手術(shù)組，I／R組，熊果酸低、中、高劑量（20 mg·kg-1、40 mg·kg-1、80 mg·kg-1）組和維拉帕米（2.5 mg·kg-1）組，每組20只。藥物溶液配制：精確稱量熊果酸后加入適量生理鹽水溶液，配制濃度為40 g·L-1的熊果酸溶液，然后依次加入0.9%氯化鈉溶液稀釋指標濃度為20 g·L-1、10 g·L-1的熊果酸溶液，同樣方法配制濃度為1.25 g·L-1的維拉帕米溶液。各組大鼠均于造模手術(shù)前7 d開始給藥（2 mL·kg-1）預(yù)處理，假手術(shù)組和I／R組同步給予等體積（2 mL·kg-1）0.9%氯化鈉溶液。參照張衛(wèi)強等［12］報道的方法復(fù)制急性心肌I／R大鼠模型：采用冠狀動脈左前降支下2 cm處結(jié)扎30 min的方法，造模過程實施心電圖監(jiān)測。以結(jié)扎后、再灌注前左心室壁呈灰白色、心電圖ST段抬高為急性心肌I／R大鼠模型成功標志。假手術(shù)組行手術(shù)通路但不結(jié)扎冠狀動脈左前降支。再灌注24 h后取材并行各指標檢測。其中I／R組大鼠死亡2只，熊果酸低、中劑量組各死亡1只，其他組大鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

2.2 指標檢測

2.2.1 監(jiān)測心電圖ST段變化觀察并記錄再灌注24 h時各組大鼠心電圖ST段高度。

2.2.2 心功能指標測定麻醉后取仰臥位固定，通過小動物超聲實時影像系統(tǒng)，取左室乳頭肌水平短軸切面檢測心功能指標：舒張／收縮末期左室內(nèi)徑（LVIDd、LVIDs）、短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）、射血分數(shù)（ejection fraction，EF）、每搏輸出量（stroke volume，SV），連續(xù)測量5個心動周期取平均值。

2.2.3 心肌組織病理學(xué)檢查和損傷評分各組分別隨機取6只大鼠，深度麻醉后開胸取心臟，4%多聚甲醛溶液固定72 h后行石蠟包埋、切片（2μm厚），經(jīng)二甲苯透明、梯度酒精脫蠟后行HE染色，中性樹膠封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理學(xué)變化。損傷評分［13］：無損傷，計0分；部分間質(zhì)水腫和局灶性心肌細胞壞死，計1分；大面積心肌細胞腫脹和壞死，計2分；血管濃縮和心肌纖維萎縮性壞死，計3分；彌漫性血管濃縮、出血和心肌壞死，計4分。每只大鼠觀察5個視野，取平均值。

2.2.4 心臟梗死體積百分比測定各組分別隨機取6只大鼠，深度麻醉后開胸取心臟，0.9%氯化鈉溶液沖洗并擦拭干凈后進行切片（厚約2 mm），然后置恒溫37℃濃度2%的NBT溶液避光孵育30 min，每5 min翻動切片一次以使之均勻著色（灰白色為心肌梗死區(qū)），拍照后應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。

腦梗死體積百分比（%）＝［（梗死面積×切片厚度）／（切片面積×切片厚度）］×100%

2.2.5 心肌生化指標測定I／R組取剩余的6只大鼠，熊果酸低、中劑量組取剩余的7只大鼠，其余組取剩余的8只大鼠，麻醉后取心臟組織，于冰上剪碎后置離心管并加入9倍量RIPA蛋白裂解液，冰水浴中研磨勻漿，低溫高速（4℃，12 000 rpm，離心半徑13.5 cm）離心15 min后取上清液。嚴格遵照試劑盒說明步驟處理后，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，生化分析法測定CAT活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，ELISA測定IL-1β、ICAM-1、IL-6、TNF-α水平。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較通過SPSS 15.0軟件行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準取α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心電圖ST段監(jiān)測結(jié)果與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠心電圖ST段明顯抬高（P＜0.01）；與I／R組比較，熊果酸中、高劑量和維拉帕米進行預(yù)處理組明顯抑制急性心肌I／R大鼠心電圖ST段抬高（P＜0.05；P＜0.01）；與維拉帕米預(yù)處理組比較，熊果酸高劑量預(yù)處理組ST段高度變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠心電圖監(jiān)測結(jié)果

3.2 心功能指標測定結(jié)果與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠LVIDd、LVIDs顯著升高，F(xiàn)S、EF、SV顯著降低（P＜0.05；P＜0.01）；與I／R組比較，熊果酸中、高劑量和維拉帕米進行預(yù)處理能夠明顯抑制急性心肌I／R大鼠LVIDd、LVIDs的升高和FS、EF、SV的降低（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高劑量預(yù)處理組LVIDs顯著低于維拉帕米預(yù)處理組（P＜0.05），其他指標兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標測定結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠心功能指標測定結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與I／R組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與維拉帕米組比較，＃P＜0.05；1 mmHg＝0.133 kPa

組別n LVIDd（P／mmHg）LVIDs（P／mmHg）FS／%EF／%SV（v／μL）82 187.62±25.65 I／R組18 7.32±0.35*6.22±0.49**16.51±3.08**30.49±6.47**80.47±18.25**熊果酸低劑量組19 7.20±0.41 5.98±0.53 18.20±3.19 33.59±7.03 87.08±21.39熊果酸中劑量組19 7.08±0.35 5.35±0.38△23.63±4.51△39.30±8.42△97.68±18.23△熊果酸高劑量組20 6.84±0.29△4.97±0.41△△＃29.27±6.04△△45.13±8.64△△122.56±23.18△△維拉帕米組20 6.76±0.30△5.43±0.40△26.52±5.79△△42.75±7.80△△116.34±21.95假手術(shù)組20 6.71±0.39 3.79±0.35 42.97±7.43 73.16±10.△△

3.3 心肌組織病理學(xué)檢查和損傷評分結(jié)果假手術(shù)組大鼠心肌組織細胞未見病理性形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變；I／R組大鼠呈現(xiàn)心肌纖維條理不清、斷裂和排列紊亂，心肌細胞腫脹、界限不清，炎性細胞浸潤等病理性改變；熊果酸或維拉帕米預(yù)處理組能夠明顯抑制急性心肌I／R大鼠心肌組織細胞病變，其中熊果酸高劑量預(yù)處理組效果更為顯著。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE，×200）

3.4 心肌組織損傷評分和心臟梗死體積百分比結(jié)果損傷評分結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠心肌組織損傷評分顯著升高（P＜0.01）；與I／R組比較，熊果酸中、高劑量和維拉帕米組可明顯降低損傷評分（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高劑量組損傷評分顯著低于維拉帕米預(yù)處理組（P＜0.05）。心臟梗死體積百分比結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠心臟梗死體積百分比顯著升高（P＜0.01）；熊果酸中、高劑量和維拉帕米組明顯降低急性心肌I／R大鼠梗死體積百分比（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高劑量組對心臟梗死的抑制作用顯著優(yōu)于維拉帕米組（P＜0.05）。見表2，圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織梗死狀況（NBT染色）

表2 各組大鼠心肌損傷評分和梗死體積百分比測定結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠心肌損傷評分和梗死體積百分比測定結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與I／R組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與維拉帕米組比較，＃P＜0.05

／%假手術(shù)組組別n 心肌組織損傷評分／分 梗死體積百分比6 0.00±0.00 0.00±0.00 I／R組6 7.35±1.97**46.95±8.51**熊果酸低劑量組6 6.85±2.42 42.18±9.43熊果酸中劑量組6 5.63±1.25△33.52±5.37△△熊果酸高劑量組6 3.54±0.60△△＃29.26±5.03△△＃維拉帕米組6 4.62±0.72△△35.94±6.27△△

3.5 心肌組織氧化應(yīng)激指標測定結(jié)果與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠心肌組織SOD、CAT活性顯著降低且MDA含量顯著升高（P＜0.01）；熊果酸中、高劑量和維拉帕米組可明顯升高急性心肌I／R大鼠心肌SOD、CAT活性且降低MDA含量（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高劑量組可升高SOD活性和降低MDA含量的作用顯著優(yōu)于維拉帕米組（P＜0.05；P＜0.01），兩組間CAT活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標測定結(jié)果（±s）

表3 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標測定結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與I／R組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與維拉帕米組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別n SOD／U·mg-1 Pro CAT／U·mg-1 Pro MDA／nmol·mg-1 Pro假手術(shù)組8 67.04±8.13 4.75±0.56 3.48±0.51 I／R組6 45.81±6.64**2.98±0.74**9.26±1.43**熊果酸低劑量組 7 49.75±7.17 3.11±0.62 7.90±1.15△熊果酸中劑量組 7 54.96±6.82△3.85±0.65△6.43±1.07△△熊果酸高劑量組 8 63.14±7.73△△＃ 3.83±0.70△4.82±0.84△△＃＃維拉帕米組8 50.28±6.94 3.36±0.52 7.07±1.12△

3.6 心肌組織炎癥因子含量測定結(jié)果與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠心肌組織IL-1β、ICAM-1、IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）；與I／R組比較，熊果酸中、高劑量組可明顯降低I／R大鼠心肌組織IL-1β、ICAM-1、IL-6、TNF-α水平（P＜0.05；P ＜0.01），維拉帕米組能夠明顯降低ICAM-1水平（P＜0.05）；熊果酸高劑量組降低對TNF-α、IL-1β、IL-6水平作用顯著優(yōu)于維拉帕米組（P＜0.05；P＜0.01），兩組間ICAM-1含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠心肌組織炎癥因子含量測定結(jié)果（±s）

表4 各組大鼠心肌組織炎癥因子含量測定結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與I／R組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與維拉帕米組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別n IL-1β（ρ／μg·L-1）ICAM-1（ρ／μg·L-1）IL-6（ρ／μg·L-1） TNF-α（ρ／μg·L-1 9.08 I／R組6 203.17±19.40**718.62±93.53**74.81±7.42**188.36±19.75**熊果酸低劑量組7 190.48±22.29 681.82±103.76 69.78±7.93 177.47±25.53熊果酸中劑量組7 164.61±20.31△547.05±82.36△△60.49±5.23△147.24±18.56△熊果酸高劑量組8 113.52±18.49△△＃＃495.61±64.79△△49.15±4.60△△＃＃134.58±13.51△△維拉帕米組8 189.28±20.87 568.14±95.27△假手術(shù)組8 32.04±4.75 355.13±41.07 25.06±3.38 66.94±69.43±7.29 167.32±21.68）＃

4 討論

急性心肌梗死是目前發(fā)病率很高且仍呈上升趨勢的缺血性心血管疾病，致殘、致死率極高［14-15］。通過藥物溶栓或介入取栓等方法及時實現(xiàn)梗死相關(guān)動脈再通，恢復(fù)血流灌注、挽救瀕死心肌細胞、減小梗死面積，是目前臨床上救治急性心肌梗死的首選方案，但I／R損傷并發(fā)癥的存在卻嚴重影響著該部分患者的預(yù)后，是臨床亟待解決的難題。

給藥預(yù)處理是臨床上預(yù)防組織器官I／R損傷的常用方案。熊果（又名熊葡萄）是杜鵑花科熊果屬的一種可藥用植物，熊果酸是其主要活性成分，是一種具有多種生物學(xué)活性的五環(huán)三萜類化合物［16］。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸能夠通過調(diào)節(jié)血脂、改善血流動力學(xué)指標、抑制主動脈病變等而對動脈粥樣硬化大鼠起到保護作用［17-18］。王金艷等［19］研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸具有抑制動脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用，但對嚴重動脈粥樣硬化導(dǎo)致急性心肌缺血并發(fā)癥后是否具有保護作用尚未見文獻報道。本研究采用冠狀動脈左前降支下2 cm處結(jié)扎30 min的方法制備急性心肌I／R大鼠模型，并于術(shù)前7 d給予熊果酸進行預(yù)處理，以維拉帕米為陽性對照藥物，維拉帕米能夠通過抑制Ca2＋內(nèi)流而減輕I／R損傷［20-21］，是臨床上治療心肌I／R損傷的常用藥物。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)熊果酸預(yù)處理能夠有效抑制急性心肌I／R大鼠心電圖ST段抬高、抑制心臟梗死體積增大、抑制心肌組織細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變和損傷評分的升高，提示熊果酸預(yù)處理對急性心肌I／R損傷具有保護作用。

超聲檢測LVIDd、LVIDs以及FS、EF、SV指標能夠及時、準確反映心臟組織功能狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)熊果酸預(yù)處理能夠有效抑制急性心肌I／R大鼠LVIDd、LVIDs升高和FS、EF、SV降低，提示熊果酸預(yù)處理具有抑制急性心肌I／R大鼠心肌損傷、保護其心功能的作用。

心肌I／R損傷病理機制非常復(fù)雜，張毅等［22］和王明娟等［23］研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在I／R病理過程中發(fā)揮著重要作用。活性氧自由基（ROS）大量生成以及抗氧化酶過度消耗是導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的根本原因，ROS攻擊不飽和脂肪酸而破壞細胞膜并損傷核酸、引發(fā)DNA斷裂，MDA為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，其含量與ROS數(shù)量成正相關(guān)，所以MDA也是評價氧化應(yīng)激損傷的敏感指標［24-25］。熊果酸具有良好的抗氧化活性。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熊果酸預(yù)處理能夠有效抑制急性心肌I／R大鼠心肌組織抗氧化酶（SOD、CAT）活力降低和MDA水平升高，提示熊果酸預(yù)處理具有抑制急性心肌I／R大鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷的作用。

急性心肌I／R后因缺血缺氧而引發(fā)心肌組織釋放粘附分子、激肽等炎性介質(zhì)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)炎性細胞趨化并聚集于心肌組織梗死區(qū)，釋放TNF-α、IL-6、ICAM-1等多種炎癥因子，并進一步促進炎癥反應(yīng)，最終形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)［26-27］。心肌組織含有能夠分泌TNF-α的巨噬細胞，而TNF-α在炎癥反應(yīng)的起始及整個過程均發(fā)揮著重要作用，并可誘導(dǎo)C反應(yīng)蛋白合成，是引發(fā)炎癥反應(yīng)的重要因子［28-29］。IL-1β參與免疫細胞聚集，為炎癥細胞因子生成創(chuàng)造條件［30］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熊果酸預(yù)處理能夠有效降低急性心肌I／R大鼠心肌組織TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-6水平，提示熊果酸預(yù)處理具有抑制急性心肌I／R大鼠心肌組織炎癥級聯(lián)反應(yīng)的作用。

綜上所述，熊果酸預(yù)處理對急性心肌I／R損傷大鼠心功能和心肌組織損傷具有保護作用，其機制可能與抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。