孫珮銘，邱萌萌，吳玉斌，陸洪省

(山東科技大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院 山東 青島 266590)

隨著對環(huán)境保護(hù)要求的提高，我國對排放污水中氮污染物限值的要求也越來越嚴(yán)格。其中，傳統(tǒng)的脫氮方法包括化學(xué)脫氮法、物理脫氮法和生物脫氮法[1]。近年來，生物脫氮法因其操作簡便、低成本效益高的優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于污水的脫氮處理[2]。最常見的生物過程包括硝化作用和反硝化作用，硝化作用是在好氧條件下，自養(yǎng)生物通過亞硝酸鹽將銨鹽氧化成硝酸與亞硝酸鹽；反硝化作用是在厭氧條件下，反硝化細(xì)菌將亞硝酸鹽與硝酸鹽轉(zhuǎn)化成氮氣，從而達(dá)到去除水體中氮的目的[3]。具體的生物法污水脫氮處理工藝包括厭氧-缺氧-好氧(A/A/O)、氧化溝工藝、CAST工藝、3A-MBR工藝、A2O-MBR工藝、A2O/A-MBR工藝、A2O/A-MBR工藝、SBR工藝、BAF工藝等[1-3]，其原理均為好氧條件下進(jìn)行硝化反應(yīng)，厭氧條件下進(jìn)行反硝化脫氮反應(yīng)，最終將污水中含氮化合物以氮氣的形式從水中逸出，達(dá)到污水脫氮目的。在污水生物脫氮處理過程中，污水中生化需氧量(biochemical oxygen demand,BOD)、N、P的比例(質(zhì)量比100∶5∶1)達(dá)到平衡是制約脫氮效果的關(guān)鍵因素，而在很多工業(yè)污水中，BOD/N/P均偏小，即污水中碳源不足，此種情況下，需補(bǔ)充額外碳源到污水中，才能獲得理想的脫氮效果。常見的碳源有葡萄糖、醋酸鈉、甲醇等，其中醋酸鈉具有價格低、易溶解、易儲存以及容易被細(xì)菌吸收的特點而被廣泛應(yīng)用，但污水中投加額外碳源又會導(dǎo)致污水處理成本的提高，因此尋找一種無需投加額外碳源的生物脫氮技術(shù)顯得非常必要。

小球藻(chlorella)為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻[4]，可以生長在高氮的生活污水中[5]，通過光合作用合成氮的有機(jī)物[6]，對污水有很好的脫氮效果[7]。國內(nèi)外在氮對小球藻生長的影響[8]、小球藻對不同氮源的吸收等方面均已有大量研究，包括對氨氮的吸收[9]、總氮的吸收[10]、硝態(tài)氮吸收和亞硝態(tài)氮吸收等[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，提高無機(jī)氮濃度有利于蛋白核小球藻的生長，其中銨態(tài)氮更利于蛋白核小球藻的生長。而碳酸酐酶胞外酶對蛋白核小球藻在無機(jī)氮的補(bǔ)償方面具有重要作用[13]。硝化細(xì)菌是一類好氧細(xì)菌，包括亞硝酸菌和硝酸菌，在污水氨氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮中發(fā)揮重要的作用[14]。硝化細(xì)菌的硝化能力受污泥負(fù)荷、污泥齡、pH、溫度、溶解氧、鹽分、堿度、污水中有毒物質(zhì)等的影響。但有關(guān)小球藻與硝化細(xì)菌共處條件下對不同氮源的吸收和利用，特別是小球藻與硝化細(xì)菌共處條件下對工業(yè)廢水處理的應(yīng)用，如屠宰廢水中氨氮和總氮去除的應(yīng)用研究非常少。

本研究利用小球藻和硝化細(xì)菌對沂南縣同德食品有限公司廢水中氨氮和總氮進(jìn)行去除，包括小球藻和硝化細(xì)菌的分離與鑒定，小球藻和硝化細(xì)菌對廢水中氨氮、總氮的去除等，以期為高濃度氨氮、總氮廢水的治理提供一定的參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

實驗所用硝化細(xì)菌和小球藻均分離于沂南縣同德食品有限公司廢水，所用培養(yǎng)基分別為硝化細(xì)菌富集液體培養(yǎng)基和BG11培養(yǎng)基。水樣為沂南縣同德食品有限公司廢水，水樣性質(zhì)：化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand,COD)26 mg/L，氨氮43.67 mg/L，總氮86.88 mg/L。

1.2 培養(yǎng)基

小球藻擴(kuò)大培養(yǎng)基均為BG11培養(yǎng)基，其組成：NaNO31.5 g/L, K2HPO40.04 g/L，MgSO4·7H2O 0.75 g/L，CaCl2·7H2O 0.036 g/L，Na2CO30.02 g/L，檸檬酸0.006 g/L，微量元素溶液(A5)1 mL/L。微量元素溶液(A5)組成：H3BO42.86 g/L，MnCl2·4H2O 1.81 g/L，ZnSO40.222 g/L，Na2MoO40.39 g/L，CuSO4·5H2O 0.079 g/L，Co(NO3)2·6H2O 49.4 g/L。

硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基組成：NH4Cl 0.382 g/L，CH3COONa 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，K2HPO40.2 g/L，NaCl 0.12 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，MnSO4·4H2O 0.01 g/L。

兩種培養(yǎng)基在使用前需用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液將液體培養(yǎng)基pH調(diào)整至7.2左右，再經(jīng)121 ℃ 20 min高壓蒸汽滅菌后使用。分離小球藻時采用平板固體培養(yǎng)基，平板培養(yǎng)基配制時需加入15 g/L瓊脂粉，其他過程同液體培養(yǎng)基制作。

1.3 硝化細(xì)菌的分離

將10 mL沂南同德食品有限公司曝氣池活性污泥加入到盛有200 mL滅菌后的硝化細(xì)菌培養(yǎng)基三角瓶中，該過程為無菌操作，混勻后置于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)4 d后，取少量培養(yǎng)液劃線到硝化細(xì)菌固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)5 d，待菌落出現(xiàn)后，挑選單菌落再重復(fù)劃線到硝化細(xì)菌固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件不變，重復(fù)上述操作直至固體平板培養(yǎng)中菌落形態(tài)一致，共分離純化到兩株硝化細(xì)菌，暫分別命名為XHL1和XHL2，將此純菌單獨保存在硝化細(xì)菌半固體培養(yǎng)基中，待用。

1.4 硝化細(xì)菌系統(tǒng)分類位置分析

硝化細(xì)菌DNA的提?。簩Ψ蛛x到的硝化細(xì)菌進(jìn)行富集培養(yǎng)基，采用柱式基因組抽提試劑盒(UNIQ-10)(生工生物工程公司(上海)股份有限公司)對富集菌液進(jìn)行DNA提取，提取方法按試劑盒說明書。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)采用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。擴(kuò)增體系設(shè)計：在0.2 mL離心管中加入2 μL上清液，再加入由27F 2μL(10 μM)、1492R 2 μL(10 μM)和MIX酶25μL組成的反應(yīng)混合液，再加重蒸水使反應(yīng)體系調(diào)至50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，30個循環(huán)，再72 ℃延伸10 min，委托上海生工生物工程公司對PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行測序。

系統(tǒng)樹的創(chuàng)建：將測得的16S rDNA序列發(fā)送到DDBJ(DNA Data Bank of Japan, http:∥www.ddbj.nig.ac.jp/)數(shù)據(jù)庫中的Blast中進(jìn)行比對，利用CustalX 2.1和Mega 5.1軟件創(chuàng)建系統(tǒng)樹，采用的方法為鄰接法[15-16]。

1.5 小球藻的分離和培養(yǎng)

將5 mL沂南同德食品有限公司二沉池上清液加入含有100 mL滅菌的BG11培養(yǎng)基的三角瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ℃，12 d后培養(yǎng)液明顯變綠，得到藻培養(yǎng)液。藻的分離采用平板法，具體過程為：將上述藻培養(yǎng)液裝入消毒過的小型噴霧器中，噴射到BG11固體平板培養(yǎng)基上，蓋好蓋，培養(yǎng)溫度為28 ℃，光照4.8±0.2 Klx(日光燈源)條件下培養(yǎng)，待長出藻菌落后，借助鏡檢用消毒過的接種環(huán)挑選實驗藻，最后將分離到的小球藻穿刺培養(yǎng)于BG11半固體培養(yǎng)基中，待用。

1.6 小球藻生物學(xué)特性

1.6.1 小球藻的外部形態(tài)觀察

將小球藻在BG11液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，取培養(yǎng)液，8 000 r/min離心10 min，傾出上層液體，用無菌水漂洗沉淀兩次，再加入1 mL 1%戊二醛固定(4 ℃過夜)，然后1 000 r/min離心10 min，最后用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，干燥，APREO掃描電鏡(美國FEI，2018)觀察其細(xì)胞形態(tài)。

1.6.2 小球藻的生長曲線測定

通過測定小球藻細(xì)胞數(shù)目制作小球藻生長曲線。小球藻細(xì)胞計數(shù)方法：將藻培養(yǎng)液用力振蕩混勻，然后于無菌操作臺取1 mL加入到2.5 mL EP管中，再加入1滴KI-I2溶液，染色15 min。培養(yǎng)條件為28 ℃，光照4.8±0.2 Klx(日光燈源)，每隔24 h取藻菌培養(yǎng)液，對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，每個樣品設(shè)三個平行，將染色后液體滴入藻細(xì)胞計數(shù)板，于光學(xué)顯微鏡(10×10)觀察并計數(shù)，每樣計數(shù)10次，計算藻細(xì)胞平均數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，藻細(xì)胞平均數(shù)目為縱坐標(biāo)制作生長曲線。

1.7 小球藻對廢水中氨氮、總氮的去除

用BG11液體培養(yǎng)基對分離到的小球藻進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)4 d，取藻培養(yǎng)液10 mL加入200 mL廢水樣品中，28 ℃條件下光照培養(yǎng)(4.8±0.2 Klx日光燈源)，每隔24 h取培養(yǎng)液，采用過濾方法去除培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞后，測定三次濾液中的氨氮和總氮含量，取平均值作為氨氮和總氮最終含量。以培養(yǎng)時間為橫軸，氨氮、總氮含量為縱軸制作曲線，并計算氨氮和總氮去除率，計算公式分別為：

CNH4-N去除率=(C初期NH4-N-C末期NH4-N)/C初期NH4-N，

(1)

CT-N去除率=(C初期T-N-C末期T-N)/C初期T-N。

(2)

測定方法：總氮(T-N)、氨氮(NH4-N)測定分別采用過硫酸鉀消解-紫外分光光度計方法和納氏試劑比色法(GB11894—89)，所用紫外可見分光光度儀型號為 UV-1200S(AOE，2018)，總氮測定用過硫酸鉀為分析純。

1.8 小球藻-硝化細(xì)菌共處對氨氮、總氮的去除測定

結(jié)合硝化細(xì)菌在分離過程中菌落生長情況，選定硝化細(xì)菌XHL1去除廢水中氨氮、總氮。將對數(shù)增長期的小球藻培養(yǎng)液、硝化細(xì)菌XHL1培養(yǎng)液以及沂南同德食品有限公司二沉池上清液按體積比1∶1∶20混勻，振蕩(轉(zhuǎn)速為150 r/min)、光照(4.8±0.2 Klx 日光燈源)、28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，每隔24 h取培養(yǎng)液，過濾去除藻細(xì)胞后進(jìn)行氨氮、總氮測定，并計算氨氮、總氮去除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻的生物學(xué)特性

2.1.1 小球藻電鏡掃描圖

將培養(yǎng)7 d時的小球藻用戊二醛固定、磷酸緩沖液沖洗、干燥后用電子顯微鏡進(jìn)行觀察(放大倍數(shù)80 000)，如圖1。從圖1可以看出，小球藻的直徑為4.5 μm，表面多褶皺，這與該小球藻進(jìn)行掃描電鏡處理時的生長時期有關(guān)，小球藻在其生長衰減期時，由于細(xì)胞內(nèi)代謝趨于衰落，內(nèi)含物排泄出細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞表面出現(xiàn)褶皺。

圖1 小球藻掃描電鏡圖

小球藻表面的褶皺增大了小球藻的表面積，增大了與氨氮和總氮的接觸面積，從而提高了小球藻對氨氮和總氮的吸收能力。另外，不同的營養(yǎng)條件以及溫度條件也會影響小球藻的大小，合適的營養(yǎng)環(huán)境，如在BOD、N和P的質(zhì)量比為100∶5∶1的污水營養(yǎng)條件下，小球藻的直徑可達(dá)5.7 μm，而環(huán)境中過高的鹽分以及有毒物質(zhì)也會導(dǎo)致小球藻脫水、直徑變小甚至死亡。本研究中，沂南縣同德食品有限公司廢水中BOD、N和P的質(zhì)量比為100∶6∶1，總氮稍高，無其他有毒物質(zhì)，對小球藻的生長無明顯抑制作用。

2.1.2 小球藻生長曲線

從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，小球藻數(shù)目持續(xù)增加，經(jīng)過6 d的培養(yǎng)，小球藻從最初的1.58×106Cells/mL上升到8.75×106Cells/mL。從第4 d開始，小球藻增值速度最快，為小球藻對數(shù)增長期，從5.6×106Cells/mL 上升至8.1×106Cells/mL，而從第5 d開始，藻細(xì)胞數(shù)目增值速度變慢，基本維持平穩(wěn)狀態(tài)，而該小球藻的停滯期非常短，可能與小球藻接種量較多有關(guān)。

圖2 小球藻生長曲線

小球藻的生長曲線包括停滯期、對數(shù)增長期、平衡期和衰減期。停滯期是小球藻進(jìn)行細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備階段，對數(shù)增長期是小球藻數(shù)目劇烈增多的階段，是小球藻代謝最旺盛的時期。本研究中小球藻對數(shù)增長期較長，表明所用培養(yǎng)基組成以及培養(yǎng)光照條件適合該小球藻的生長。

2.2 硝化細(xì)菌分類學(xué)位置分析

利用硝化細(xì)菌的分離培養(yǎng)基，經(jīng)過多次分離純化，從沂南縣同德食品有限公司廢水中分離到兩株硝化細(xì)菌，菌株菌落形態(tài)如圖3所示。從圖3可以看出，兩菌株菌落均為光滑型，形態(tài)基本一致，但菌株XHL1菌落為淡黃色，菌落直徑較大，表面有凸起，菌落數(shù)目較少；而菌株XHL2菌落為乳白色，表面光滑，且菌落數(shù)目較多，細(xì)胞表面分泌黏性物質(zhì)，為多糖類物質(zhì)。為進(jìn)一步對兩菌株進(jìn)行鑒定，對兩菌株進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增并測序，將測序得到的序列在DDBJ數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株XHL1和XHL2分別與Acinetobacterbaumanniistrain SO20(HQ631961)和Acinetobactersp.2C56(JN228308)的同源性最高，分別高達(dá)100%和99%。利用MEGA5.1軟件對同源性較高的序列進(jìn)行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。從圖4可以看出，分離到的菌株XHL1和XHL2在同一分支上，兩菌株親緣關(guān)系非常近，證明為同一屬細(xì)菌，因此，該系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果從基因水平上也為兩菌株菌落形態(tài)基本一致的結(jié)果提供了支撐。

圖3 菌株XHL1(a)和菌株XHL2(b)平板菌落

圖4 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

通過對兩菌株的外部形態(tài)進(jìn)行比較，結(jié)合基因序列以及系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，從不同角度得出的結(jié)論是一致的。本實驗中，兩菌株從食品廠廢水中分離而來，這與廢水中高濃度銨態(tài)氮密切相關(guān)。

2.3 小球藻對氨氮和總氮的去除效果

小球藻單獨處理廢水中的氨氮和總氮，結(jié)果如表1所示。由表1可見，經(jīng)過4 d的培養(yǎng)，沂南同德食品有限公司二沉池上清液中氨氮含量從未處理前的43.67 mg/L降至2.54 mg/L，去除率為94.18%;同時總氮從未處理前的86.88 mg/L降低到13.52 mg/L，去除率為84%。

小球藻對水體中不同形態(tài)氮的吸收能力不同，其吸收的順序為:氨氮>簡單有機(jī)氮>硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，其中小球藻將吸收的氨氮完全轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)、葉綠素等細(xì)胞含氮物質(zhì)。從表1也可以看出，小球藻對氨氮的去除率高于對總氮的去除率。這是因為沂南縣同德食品有限公司的污水經(jīng)過氨化反應(yīng)后，污水中的氮基本為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，即污水中總氮包括銨態(tài)氮和硝態(tài)氮兩種，這與小球藻對氨氮的吸收能力高于對硝態(tài)氮的吸收結(jié)論相一致。

表1 小球藻單獨培養(yǎng)對氨氮和總氮的去除

2.4 小球藻與硝化細(xì)菌共培養(yǎng)去除氨氮、總氮

硝化細(xì)菌XHL1與小球藻按相同的體積比接種到沂南縣同德食品有限公司二沉池上清液中進(jìn)行培養(yǎng)，并測定培養(yǎng)液中氨氮和總氮的含量，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，在硝化細(xì)菌-小球藻共處條件下，氨氮含量從未處理前的43.67 mg/L降至0.32 mg/L，去除率為99.3%。廢水中總氮從未處理前的86.88 mg/L降到18.9 mg/L，去除率為78%。

表2 小球藻與硝化細(xì)菌XHL1共處對氨氮和總氮的去除

A-A-O是污水處理廠去除氨氮和總氮的最為常見的工藝，機(jī)理是污水中的銨態(tài)氮在硝化細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，從而呈現(xiàn)銨態(tài)氮降低的現(xiàn)象。而總氮的減少是在污水中反硝化細(xì)菌的脫氮作用下，將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氮氣從水體中溢出而減小。廢水中總氮包括氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和其他有機(jī)態(tài)氮。表1、表2結(jié)果表明，小球藻單獨存在時對廢水中氨氮去除率為94.18%，低于小球藻和硝化細(xì)菌XHL1共處條件下對氨氮的去除率(99.3%)，這可能是小球藻和硝化細(xì)菌XHL1共同對氨氮的吸收所致；而小球藻單獨存在時總氮的去除率為84%，遠(yuǎn)高于小球藻-硝化細(xì)菌共處條件下對總氮的去除率(78%)，這可能是小球藻-硝化細(xì)菌共處時硝化細(xì)菌XHL1將氨氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮又釋放到水體中的緣故。

3 結(jié)論

從山東省沂南縣同德食品有限公司廢水中分離得到兩株硝化菌(XHL1和 XHL12)及小球藻。對兩株硝化細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA 提取、測序和同源性分析，鑒定該兩菌株屬于Acinetobactersp.菌屬。對從該廢水中分離到的小球藻用掃描電鏡進(jìn)行了外部形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞直徑為4.5 μm，對數(shù)增長期出現(xiàn)在第4 d。

小球藻單獨存在條件下對廢水中氨氮的去除效率為94.18%，總氮的去除率為84%。小球藻-硝化細(xì)菌共處條件下對廢水中氨氮的去除效率為99.3%，總氮的去除率為78%，而未對小球藻對COD、總磷的去除效果進(jìn)行研究。陸洪省等[17]對從養(yǎng)豬廢水中分離到的蛋白核小球藻進(jìn)行了研究，分析了該蛋白核小球藻對養(yǎng)豬廢水中COD、總磷的去除率分別為70.9%和34.7%。本研究在小球藻-硝化細(xì)菌共處條件下對食品廠廢水中的氨氮、總氮的去除進(jìn)行了分析，證明了兩者共處條件下促進(jìn)了對污水中氨氮的去除，為兩者在污水實際處理過程中的應(yīng)用提供了新的途徑。本研究中分離到的小球藻來源于屠宰廢水，這與陸洪省等[17]在養(yǎng)豬廢水中分離到的蛋白核小球藻有可能不屬于同一種小球藻，因此，對目前分離到的小球藻在廢水處理中的其他方面的應(yīng)用需要進(jìn)一步研究，為小球藻在污水處理中的實際應(yīng)用打下基礎(chǔ)。