張巧鴿，王麗英

（1.舞鋼市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南 平頂山 462500；2.舞鋼市農(nóng)技推廣中心，河南 平頂山 462500）

小球藻（）為優(yōu)質(zhì)蛋白餌料，其蛋白含量通常占藻體干質(zhì)量的50%左右，藻體內(nèi)含有多種必需氨基酸，也有豐富的維生素與礦物質(zhì)元素，可高效地轉(zhuǎn)化養(yǎng)殖水體中的有毒有害物質(zhì)，因此，高效培養(yǎng)小球藻很有必要。為探究植物促生長劑對小球藻生長的影響，選取3種植物促生長劑，分別為新福鈉、吲哚丁酸鉀和胺鮮酯（DA-6），設(shè)置不同濃度梯度，探究它們對小球藻各項指標(biāo)影響的最適濃度，為小球藻的高效培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用無菌培養(yǎng)的蛋白核小球藻（以下簡稱小球藻）作為試驗的培養(yǎng)藻，藻種由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院水產(chǎn)實(shí)驗室提供。純度均為98%的新福鈉、吲哚丁酸鉀和DA-6購自鄭州信聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

將配制好的BG-11培養(yǎng)基用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，將培養(yǎng)基放置于YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，在121.5℃條件下滅菌30 min，取出后冷卻至室溫備用。

1.2.2 藻種擴(kuò)培、接種與培養(yǎng)

將冷卻至室溫的BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行紫外線滅菌，然后移到酒精燈附近進(jìn)行分裝，將100 mL藻種接種到分裝后的BG-11培養(yǎng)基內(nèi)。按照上述滅菌方法和接種步驟，分別在含有不同濃度新福鈉、吲哚丁酸鉀和DA-6的培養(yǎng)基內(nèi)接種10 mL擴(kuò)培后的小球藻種，每3個錐形瓶添加一個濃度作為平行，按照恒溫30℃、光強(qiáng)3 000 lx、光暗比14 h∶10 h的培養(yǎng)條件在搖床上培養(yǎng)。每間隔24 h取樣一次，用血球板計數(shù)法進(jìn)行5點(diǎn)取樣，記錄小球藻的生長情況并繪制其生長曲線，連續(xù)培養(yǎng)5 d后測定其光合色素含量。

1.2.3 細(xì)胞密度值測定與光密度值（OD）測定

（1）小球藻細(xì)胞密度值測定。每平行組分別在0，24，48，72，96和120 h各取樣一次，用6個血球計數(shù)板，在顯微鏡下對不同濃度梯度的各平行組小球藻原液放大400倍觀察并計數(shù)，記錄各濃度下小球藻細(xì)胞數(shù)量。（2）小球藻細(xì)胞光密度值（OD）測定。小球藻的細(xì)胞密度與波長680 nm處的吸光度之間的線性關(guān)系如圖1所示?？衫眯∏蛟逶旱奈舛戎底鳛楹饬啃∏蛟寮?xì)胞密度的間接指標(biāo)，利用UV-1800紫外可見分光光度計，在波長680 nm處測量各平行組內(nèi)小球藻的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

圖1 小球藻細(xì)胞密度與波長680 nm處吸光度值的線性關(guān)系

1.2.4 小球藻光合色素的提取與含量測定

（1）光合色素的提取。取不同濃度的各平行組培養(yǎng)基原液，用離心機(jī)離心5 min，去掉上清液后加入甲醇溶劑重懸，在嚴(yán)格避光條件下，靜置24 h以上，直到濃縮后的小球藻細(xì)胞完全變成白色殘渣。將經(jīng)甲醇處理后的藻液在4℃條件下3 000 r/min離心5 min，取上清液。（2）光合色素含量的測定。以甲醇溶劑為空白調(diào)零，用UV-1800紫外可見分光光度計分別測定666，653和470 nm下不同濃度各平行組藻液的吸光度值，獲取的數(shù)據(jù)代入以下公式（1），（2）和（3），分別計算葉綠素b、葉綠素a和類胡蘿卜素的含量。

式中：A653、A666、A470為葉綠素溶液在波長653 m、666 nm、470 nm時的吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0軟件，對試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物促生長劑對小球藻生長的影響

2.1.1 新福鈉對小球藻生長的影響

不同濃度的新福鈉對小球藻細(xì)胞密度的影響見圖2。由圖2可見，與對照組（0 mg/L組）相比，添加48 h后，10，20，40，80和160 mg/L新福鈉對小球藻生長影響不明顯（>0.05）；72 h后，40，80和160 mg/L的新福鈉顯著抑制小球藻細(xì)胞的生長（<0.05），20 mg/L的新福鈉抑制效果不明顯；120 h后，10 mg/L的新福鈉顯著促進(jìn)小球藻細(xì)胞的生長（<0.05），與對照組相比，細(xì)胞密度增加了16.7%；與對照組相比，添加量為20，40，80和160 mg/L的新福鈉小球藻的細(xì)胞密度分別減少了7.37%，33.3%，45.9%和63.8%（<0.05）。

圖2 不同濃度的新福鈉對小球藻細(xì)胞密度的影響

試驗結(jié)果顯示，與其他植物促生長劑一樣，新福鈉對小球藻的作用效果與濃度有關(guān)。10 mg/L新福鈉能顯著促進(jìn)小球藻的生長，提高細(xì)胞密度（<0.05）。高濃度新福鈉抑制小球藻生長，20，40，80和160 mg/L的新福鈉對小球藻的生長均起到顯著的抑制作用（<0.05），該試驗結(jié)果與唐明虎等的研究相似。

2.1.2 吲哚丁酸鉀對小球藻生長的影響

不同濃度的吲哚丁酸鉀對小球藻細(xì)胞密度的影響見圖3。從圖3可見，與對照組相比，添加48 h后，10，20和40 mg/L吲哚丁酸鉀對小球藻細(xì)胞生長沒有明顯影響，80和60 mg/L的吲哚丁酸鉀顯著抑制小球藻細(xì)胞的生長（<0.05）。72 h后，40 mg/L的吲哚丁酸鉀顯著抑制小球藻細(xì)胞生長。120 h后，10和20 mg/L吲哚丁酸鉀顯著促進(jìn)小球藻細(xì)胞生長（<0.05），與對照組相比，細(xì)胞密度分別增加了11.0%和28.9%。40，80和160 mg/L吲哚丁酸鉀顯著抑制細(xì)胞生長（<0.05），與對照組相比，細(xì)胞密度分別減少了21.0%，41.9%和57.1%。

圖3 不同濃度的吲哚丁酸鉀對小球藻細(xì)胞密度的影響

試驗結(jié)果顯示，10和20 mg/L的吲哚丁酸鉀能顯著促進(jìn)小球藻的生長（<0.05），而40，80和160 mg/L吲哚丁酸鉀則顯著抑制小球藻的生長（<0.05）。本試驗結(jié)果與周曉歡、鄧曉東等的研究結(jié)果和推論相一致。

2.1.3 DA-6對小球藻生長的影響

不同濃度的DA-6對小球藻細(xì)胞密度的影響見圖4。由圖4可見，添加48 h后，10 mg/L的DA-6顯著促進(jìn)小球藻細(xì)胞的生長（<0.05）。與對照組相比，40和80 mg/L DA-6對小球藻生長有顯著抑制作用（<0.05）。72 h后，80 mg/L的DA-6顯著抑制小球藻生長（<0.05）。120 h后，與對照組相比，10 mg/L的DA-6顯著促進(jìn)小球藻生長（<0.05），細(xì)胞密度增加33.2%；20，40和80 mg/L DA-6顯著抑制小球藻的生長（<0.05），細(xì)胞密度分別比對照組減少了37.1%，50.5%和64.4%。

圖4 不同濃度的DA-6對小球藻細(xì)胞密度的影響

DA-6作為一種化學(xué)合成的植物促生長劑，可以促進(jìn)葉綠素、蛋白質(zhì)和核酸的合成。試驗結(jié)果顯示，5和10 mg/L的DA-6能夠顯著促進(jìn)小球藻生長，而20，40和80 mg/L的DA-6則抑制小球藻生長。

2.2 植物促生長劑對小球藻光合色素含量的影響

2.2.1 新福鈉對小球藻光合色素含量的影響

不同濃度新福鈉對光合色素的影響見表1。由表1可見，與對照組相比，在10 mg/L新福鈉的誘導(dǎo)下，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別增加了7.67%，34.6%和20.3%，3種光合色素含量均顯著高于對照組（<0．05）。在20 mg/L新福鈉的誘導(dǎo)下，小球藻3種光合色素含量與對照組相比，變化不明顯。在40，80和160 mg/L新福鈉的誘導(dǎo)下，3種光合色素的含量被顯著抑制（<0．05）。

表1 不同濃度新福鈉對光合色素的影響① mg/L

2.2.2 吲哚丁酸鉀對小球藻光合色素含量的影響

不同濃度吲哚丁酸鉀對光合色素的影響見表2。由表2可見，與對照組相比，在10 mg/L吲哚丁酸鉀的誘導(dǎo)下，葉綠素a含量顯著增加了6.97%（<0.05）。在20 mg/L吲哚丁酸鉀的誘導(dǎo)下，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別顯著增加了12.6%，29.2%和46.1%（<0.05）。在40 mg/L吲哚丁酸鉀的誘導(dǎo)下，葉綠素a含量顯著高于對照組（<0.05）。在80和160 mg/L吲哚丁酸鉀的誘導(dǎo)下，光合色素含量均顯著低于對照組（<0.05）。

表2 不同濃度吲哚丁酸鉀對光合色素的影響①mg/L

2.2.3 DA-6對小球藻光合色素含量的影響

不同濃度DA-6對光合色素的影響見表3。由表3可見，與對照組相比，在5 mg/L DA-6的誘導(dǎo)下，葉綠素b的含量顯著增加了10.9%（<0.05）。在10 mg/L DA-6的誘導(dǎo)下，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量顯著增加了24.6%，41.9%和21.5%。在20 mg/L DA-6的誘導(dǎo)下，葉綠素a和類胡蘿卜素含量顯著低于對照組（<0.05）。在40和80 mg/L DA-6的誘導(dǎo)下，光合色素含量均顯著低于對照組（<0.05）。

表3 不同濃度DA-6對光合色素的影響① mg/L

3 結(jié)論

低濃度的3種植物促生長劑（新福鈉、吲哚丁酸鉀和DA-6）能有效促進(jìn)小球藻的生長和光合色素含量的積累，且小球藻的細(xì)胞密度、吸光度與光合色素含量的總體變化趨勢一致，先增高后降低。而過高濃度的3種植物促生長劑對小球藻的光合色素合成有抑制作用，可能導(dǎo)致小球藻生長被抑制。所以只有選擇適當(dāng)?shù)闹参锎偕L劑濃度才能較好地促進(jìn)小球藻生長。

根據(jù)本試驗結(jié)果，3種植物促生長劑的最適濃度分別是新福鈉10 mg/L，吲哚丁酸鉀20 mg/L和DA-6 10 mg/L。由于本試驗濃度梯度設(shè)置較大，為使研究結(jié)果更準(zhǔn)確，應(yīng)該選擇更小的濃度梯度開展進(jìn)一步試驗。此外，還可以增加蛋白質(zhì)、氨基酸和脂肪酸含量等營養(yǎng)指標(biāo)和抗氧化（超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶）指標(biāo)的測定，篩選出3種植物促生長劑的最佳添加濃度，為規(guī)?；a(chǎn)小球藻提供一定的參考依據(jù)。