唐蘭芳，王 鋒 *，譚興和，郭紅英，劉志偉，蘇小軍，3，李清明，張錦鈺，秦 丹

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128）

拐棗（Hovenia acerba），學(xué)名枳椇，系鼠李科（Rhamnaceae）枳椇屬（Hovenia）植物的果實(shí)，又名雞爪連、甜半夜等，其果實(shí)形態(tài)似萬字符，有萬壽果的美譽(yù)[1]。拐棗含糖量高，且果香濃郁，是制備果酒的優(yōu)良原料[2]。拐棗果酒的加工不僅可以實(shí)現(xiàn)拐棗資源高效利用，也符合我國當(dāng)前酒類從烈性型酒向營養(yǎng)型酒轉(zhuǎn)變和從糧食類酒向果酒轉(zhuǎn)變的消費(fèi)結(jié)構(gòu)調(diào)整趨勢。我國很多農(nóng)村地區(qū)都有利用拐棗制酒的傳統(tǒng)，將拐棗加入到一定量的白酒中進(jìn)行泡制，制成拐棗露酒，或?qū)⒐諚椘扑樘幚斫臃N發(fā)酵劑得到拐棗發(fā)酵酒?！兜崮媳静荨分芯驮岬剑諚椗菥品?，具有舒通筋絡(luò)、安神保健等功效[3]。

自由基是人體內(nèi)的正常代謝產(chǎn)物，在常態(tài)下，人體內(nèi)的自由基處于動(dòng)態(tài)平衡中，然而該平衡一旦被打破，就會(huì)對機(jī)體造成損害，從而引發(fā)諸如高血壓、糖尿病等一系列相關(guān)疾病。攝入一定量的抗氧化食物，對人體的保健作用已得到證實(shí)[4-5]，果酒的抗氧化能力是果酒的重要功能特性，流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，葡萄酒由于富含多種天然抗氧化劑而具有很強(qiáng)的抗氧化能力，能起到保護(hù)心腦血管的作用[6]。拐棗富含酚類、多糖、生物堿等活性成分[7-8]，具有解酒保肝、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)多種保健功能[9-10]。將拐棗加工成拐棗發(fā)酵酒或拐棗露酒，是否仍能保持其強(qiáng)抗氧化性能還有待研究，且酒中多酚、黃酮含量與其抗氧化能力的關(guān)系，目前也鮮見報(bào)道。

本研究擬比較拐棗發(fā)酵酒與拐棗露酒中總酚、總黃酮、總糖、抗壞血酸等成分的含量差異，采用氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）、鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）與2,2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除能力4種抗氧化體系評(píng)價(jià)其抗氧化活性，以期為拐棗酒的加工提供理論指導(dǎo)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

拐棗：采自瀏陽市大圍山；邵陽大曲（酒精度為52%vol）：湖南湘窖酒業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.04%）：成都曼思特生物科技有限公司；熒光素鈉、奎諾二甲基丙烯酸（水溶性維生素E）（純度為97%）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（純度為97%）、葡萄糖分析對照品（純度≥99%）、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.9%）：上海麥克林生化科技有限公司；DPPH（純度＞97%）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ABTS（純度≥98%）、2,4,6-三吡啶基三嗪（純度≥98%）、2,6-二氯靛酚鈉鹽（純度≥97%）、果膠酶（500 U/mg）：上海瑞永生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGW16臺(tái)式高速微量離心機(jī)：長沙英泰儀器有限公司；H-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；WFJ-7200型可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Varioskan Lux多功能微孔讀數(shù)儀：美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 拐棗酒制備工藝

（1）拐棗發(fā)酵酒

拐棗前處理→破碎→酶解→主發(fā)酵→過濾→后發(fā)酵→澄清→成品

操作要點(diǎn)：

拐棗前處理：挑選完好無損傷的拐棗，洗凈瀝干，剪去拐棗枝；

破碎：加入拐棗等質(zhì)量的純凈水進(jìn)行破碎處理，裝入發(fā)酵容器；

酶解：加入0.6 g/L果膠酶溶液，室溫（20～25 ℃）酶解8 h；

主發(fā)酵：按0.05 g/L加入5%的食品級(jí)亞硫酸與0.4 g/L溫水活化的安琪酵母，室溫（20～25 ℃）主發(fā)酵10～15 d，當(dāng)酒精度不再變化，即主發(fā)酵完成；

后發(fā)酵：用紗布過濾除渣，于室溫下后發(fā)酵15 d，澄清，即得拐棗發(fā)酵酒。

（2）拐棗露酒

拐棗前處理→加酒浸泡→過濾→成品

操作要點(diǎn)：拐棗果皮具有一定澀味，為保證口感，在制備露酒時(shí)拐棗與酒的比例不宜過大。將洗凈瀝干的拐棗，以邵陽大曲為酒基，液料比（mL∶g）為2.5∶1.0、3.5∶1.0、4.5∶1.0分別進(jìn)行泡制，室溫（20～25 ℃）避光放置45 d，過濾除去拐棗，即得拐棗露酒。

1.3.2 拐棗酒理化指標(biāo)測定

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，測定樣品酒精度及抗壞血酸含量[11]；采用福林酚法，測定樣品中總多酚含量[12]；采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，測定樣品中總黃酮含量[13]；采用3,5-二硝基水楊酸法測定樣品總糖與還原糖含量[14]。

1.3.3 拐棗酒體外抗氧化試驗(yàn)

ORAC值的測定：參照文獻(xiàn)[15]測定拐棗酒的ORAC值，以濃度為12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200μmol/L、400μmol/L的水溶性維生素E代替樣品作熒光衰退曲線，計(jì)算曲線下凈面積（the area under the curve，AUC），以水溶性維生素E濃度（x）為橫坐標(biāo)，AUC（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=36.988x+376.39，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 3，線性關(guān)系良好。樣品的抗氧化能力最終由ORAC值，即水溶性維生素E當(dāng)量濃度（mmol/L）表示。

FRAP值的測定：參照文獻(xiàn)[16]測定拐棗酒的FRAP值，以硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品最終的總抗氧化能力以硫酸亞鐵當(dāng)量濃度（mmol/L）表示。

ABTS自由基清除能力的測定：參照文獻(xiàn)[17]，配制7 mmol/L的ABTS甲醇溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液，等體積混合避光反應(yīng)12 h，得ABTS混合液，吸取適量ABTS混合液，甲醇稀釋至其在波長734 nm處的吸光度值為0.700±0.050，得ABTS工作液。準(zhǔn)確吸取ABTS工作液2.7 mL與0.3 mL樣品溶液混合，搖勻，室溫避光反應(yīng)10 min，采用分光光度計(jì)在波長734 nm處測其吸光度值A(chǔ)s。對照組以0.30 mL甲醇溶液代替樣品，測其吸光度值A(chǔ)c，計(jì)算ABTS自由基清除率，其計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除能力的測定：參照文獻(xiàn)[18]，配制100 μmol/L的DPPH甲醇溶液，準(zhǔn)確吸取0.5 mL樣品溶液與3.0 mL DPPH溶液混合，搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min，采用分光光度計(jì)在波長517 nm處測其吸光度值A(chǔ)j。對照組以0.5 mL甲醇溶液代替樣品，測其吸光度值A(chǔ)i，計(jì)算DPPH自由基清除率，其計(jì)算公式如下：

自由基清除能力通常由樣品的半抑制濃度（halfinhibitory inhibitory concentration，IC50）值表示。本試驗(yàn)以維生素C（vitamin C，VC）作為陽性對照，其清除ABTS與DPPH自由基的IC50值由SPSS軟件進(jìn)行曲線擬合所得。拐棗酒對兩種自由基清除能力的IC50值，根據(jù)其稀釋倍數(shù)，最終結(jié)果以VC質(zhì)量濃度（μg/mL）當(dāng)量抗氧化能力表示。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2007、SPSS19.0與Origin 8.5進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用最小顯著差數(shù)法（least significance difference，LSD）進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同拐棗酒理化指標(biāo)測定結(jié)果

不同拐棗酒理化指標(biāo)測定結(jié)果見表1。

表1 拐棗露酒與發(fā)酵酒理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of blended and fermented Hovenia acerba alcoholic beverage

植物多酚、黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抑菌等功能活性[19-20]。由表1可知，拐棗露酒及發(fā)酵酒均含有一定量的多酚與黃酮，且含量差異顯著（P＜0.05）。拐棗露酒中多酚、黃酮含量隨著液料比的減小而增大，以液料比為2.5∶1.0（mL∶g）的拐棗露酒含量最高，其總多酚含量為（1.04±0.01）mg/mL，總黃酮含量為（0.26±0.003）mg/mL。拐棗發(fā)酵酒中總多酚含量為（1.13±0.006）mg/mL，總黃酮含量為（0.34±0.005）mg/mL，顯著高于拐棗露酒（P＜0.05）。多酚和黃酮的溶出大大增強(qiáng)了拐棗酒的抗氧化能力，提高了酒的營養(yǎng)價(jià)值。

抗壞血酸含量與抗氧化能力關(guān)系密切，但成熟拐棗的抗壞血酸含量較低。由表1可知，拐棗露酒與發(fā)酵酒中均含有少量抗壞血酸，且含量差異顯著（P＜0.05）。拐棗露酒中抗壞血酸含量隨拐棗液料比的減小而增大，以液料比為2.5∶1.0（mL∶g）的拐棗露酒含量最高，為（9.84±0.67）mg/L，拐棗發(fā)酵酒的抗壞血酸含量為（13.39±0.51）mg/L，顯著高于拐棗露酒（P＜0.05）。拐棗發(fā)酵酒中抗壞血酸含量與文獻(xiàn)報(bào)道的歐李果酒中抗壞血酸含量接近[21]。

由表1可知，隨著液料比的減小，拐棗露酒中糖類溶出增加，以液料比為2.5∶1.0（mL∶g）的拐棗露酒總糖及還原糖含量最高，分別為（142.03±1.68）mg/mL、（137.30±1.40）mg/mL，顯著高于拐棗發(fā)酵酒（13.60±0.32）mg/mL、（13.00±0.01）mg/mL（P＜0.05）。糖的溶出，不僅了改善酒的口感，也提高了酒的營養(yǎng)價(jià)值，4種拐棗酒中總糖含量與還原糖含量均差異顯著（P＜0.05）。

2.2 拐棗酒體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同拐棗酒氧自由基吸收能力比較

ORAC法是目前檢測抗氧化劑抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品等抗氧化能力的檢測[22]。不同拐棗酒的ORAC值見圖1。

圖1 不同拐棗酒的氧自由基吸收能力值Fig.1 Oxygen radical absorption capacity value of different Hovenia acerba alcoholic beverage samples

由圖1可知，拐棗露酒的ORAC值隨液料比的減小而增大，當(dāng)液料比為2.5∶1.0（mL∶g）時(shí)，拐棗露酒的ORAC值最大達(dá)（9.12±1.48）mmol/L，而拐棗發(fā)酵酒的ORAC值為（14.69±1.31）mmol/L，顯著大于拐棗露酒（P＜0.05），表明拐棗發(fā)酵酒的抗氧化能力更強(qiáng)。CAO G等[23]對水果的總抗氧化能力進(jìn)行研究，結(jié)果表明葡萄汁的ORAC值約為15 mmol/L，葡萄酒的ORAC值為（12.34±0.47）mmol/L，與拐棗發(fā)酵酒的ORAC值相近；拐棗露酒的ORAC值大于該文獻(xiàn)報(bào)道的橘子汁、蘋果汁等常見果汁的ORAC值。李擁軍等[24]在研究單樅茶酒抗氧化作用中表明，單樅茶酒ORAC值在30 mmol/L左右，約為拐棗發(fā)酵酒的2倍。

2.2.2 不同拐棗酒Fe3+還原能力比較

FRAP值越大，表明樣品的Fe3+還原力越強(qiáng)。不同拐棗酒的FRAP值見表2。

表2 不同拐棗酒的鐵離子還原能力值Table 2 Ferric ion reducing antioxidant power value of different Hovenia acerba alcoholic beverage samples

由表2可知，不同拐棗酒之間的FRAP值均存在顯著差異（P＜0.05），拐棗露酒的FRAP值隨液料比的減小而增大，當(dāng)料液比為2.5∶1.0（mL∶g）時(shí)，拐棗露酒的FRAP值最高，為（6.09±0.05）mmol/L。拐棗發(fā)酵酒的FRAP值為（11.71±0.13）mmol/L，顯著高于拐棗露酒（P＜0.05），表明拐棗發(fā)酵酒的Fe3+還原能力比拐棗露酒更強(qiáng)。

2.2.3 不同拐棗酒清除ABTS與DPPH自由基能力比較

DPPH與ABTS自由基清除能力的測定是常見的體外抗氧化方法，兩種自由基被清除的機(jī)制不同，前者主要涉及氫轉(zhuǎn)移，后者是一種帶正電荷的自由基，它的清除過程主要涉及電子轉(zhuǎn)移。拐棗酒對ABTS、DPPH自由基的清除作用見圖2，IC50值見表3。

圖2 拐棗酒對2,2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（a）及1,1-二苯基-2-苦肼基（b）自由基的清除作用Fig.2 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (a) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (b) free radical scavenging ability of different Hovenia acerba alcoholic beverage samples

由圖2可知，不同拐棗酒對ABTS、DPPH自由基均表現(xiàn)出強(qiáng)清除率，未稀釋的4種拐棗酒對ABTS自由基的清除率接近100%，對DPPH自由基的清除率達(dá)90%以上。在兩類自由基清除試驗(yàn)中，清除效果均以拐棗發(fā)酵酒最突出，拐棗發(fā)酵酒在稀釋60倍、24倍后，對ABTS、DPPH自由基的清除率分別達(dá)50%、40%以上。將0.5 mg/mL的VC溶液按不同稀釋倍數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，作為拐棗酒抗氧化能力的陽性對照，隨著稀釋倍數(shù)增大，VC溶液對兩種自由基的清除率下降迅速。在稀釋50倍，即VC質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL 時(shí)，其對ABTS自由基的清除率為31.13%；在稀釋16倍，即VC質(zhì)量濃度為0.031 25 mg/mL時(shí)，其對DPPH自由基的清除率為37.57%。

表3 拐棗酒清除2,2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽與1,1-二苯基-2-苦肼基自由基的IC50值Table 3 IC50 of different Hovenia acerba alcoholic beverage samples scavenging 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical

由表3可知，在DPPH自由基清除試驗(yàn)中，VC溶液的IC50值為（43.04±1.93）μg/mL，大于液料比為2.5∶1.0（mL∶g）的拐棗露酒和拐棗發(fā)酵酒的IC50值，表明這兩種拐棗酒對DPPH自由基的清除能力要高于VC。在ABTS自由基清除能力中，VC溶液的IC50值為（16.12±1.80）μg/mL，僅低于液料比為4.5∶1.0的拐棗露酒，這表明VC對ABTS自由基的清除能力僅高于4.5∶1.0的拐棗露酒，液料比為3.5∶1.0、2.5∶1.0的拐棗露酒與拐棗發(fā)酵酒的ABTS自由基清除能力均高于VC。拐棗酒清除ABTS自由基的能力遠(yuǎn)大于DPPH自由基，與MAIEVES H A等[25]研究的拐棗多糖趨勢一致。

2.3 拐棗酒中活性成分與抗氧化相關(guān)性分析

植物的抗氧化作用與其含有的活性成分如多酚、黃酮類物質(zhì)的含量、種類、結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[26]。拐棗酒中總多酚、總黃酮、抗壞血酸含量與4種抗氧化試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)見表4。

由表4可知，3種活性成分的含量與抗氧化活性的相關(guān)性強(qiáng)?？偠喾雍颗cFe3+還原能力、氧自由基吸收能力相關(guān)性顯著（P＜0.05），與DPPH、ABTS自由基清除能力相關(guān)性呈極顯著（P＜0.01）?？傸S酮與抗壞血酸含量對4種抗氧化試驗(yàn)都呈現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)影響（P＜0.01）。ABTS試驗(yàn)中，3種活性成分對其影響大小為：總黃酮＞抗壞血酸＞總多酚；DPPH、FRAP、ORAC試驗(yàn)中，3種活性成分對其影響大小均表現(xiàn)為：抗壞血酸＞總黃酮＞總多酚。

表4 拐棗酒中總黃酮、總多酚、抗壞血酸與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlations between antioxidant activities and total phenols,total flavonoids and ascorbic acid contents in Hovenia acerba alcoholic beverage samples

3 結(jié)論

拐棗露酒與拐棗發(fā)酵酒中都含有較高含量的多酚、黃酮、抗壞血酸活性成分，且口感、風(fēng)味良好，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，適當(dāng)飲用對人體大有裨益。拐棗酒中多酚、黃酮、抗壞血酸含量均以拐棗發(fā)酵酒更高，含量分別為1.13 mg/mL、0.34mg/mL、13.39mg/L，而糖含量則以液料比為2.5∶1.0（mL∶g）的拐棗露酒更高，其總糖含量達(dá)142.03 mg/mL，還原糖含量達(dá)137.30 mg/mL。兩種工藝拐棗酒均具有很強(qiáng)的體外抗氧化能力，其總抗氧化能力與之含有的抗壞血酸、總多酚、總黃酮含量密切相關(guān)。拐棗露酒總體風(fēng)味依賴于酒基，可改善酒基風(fēng)味，拐棗露酒以液料比為2.5∶1.0（mL∶g）進(jìn)行泡制為宜，其口感醇和，抗氧化能力強(qiáng)；與拐棗露酒相比，拐棗發(fā)酵酒中活性成分含量更高，抗氧化能力更強(qiáng)，其ORAC值與FRAP值分別達(dá)14.69 mmol/L、11.71 mmol/L，對ABTS、DPPH自由基的清除率均＞90%，清除ABTS與DPPH自由基的IC50值以VC當(dāng)量抗氧化能力表示分別為7.10 μg/mL、23.40 μg/mL。

我國拐棗資源豐富，以拐棗為原料加工成拐棗發(fā)酵酒或拐棗露酒，是拐棗資源高值化利用的良好途徑，對開發(fā)山區(qū)資源，帶動(dòng)農(nóng)民致富具有積極的意義。此外，充分利用拐棗濃郁的果香，將拐棗與其他水果進(jìn)行混合發(fā)酵，制成復(fù)合果酒，也將具有廣闊前景。