白玉峰，張文霞，田亞楠，張秀艷*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

蘋果酸是葡萄果實成熟過程中形成的一種重要的有機酸，它的含量因葡萄品種以及葡萄成熟的條件不同而不同，過量蘋果酸會影響葡萄酒的酸度和感官品質(zhì)[1]。葡萄中的蘋果酸異構(gòu)體為L型[2]，L-蘋果酸不僅影響葡萄酒的酸度及感官品質(zhì)，而且影響葡萄酒中微生物穩(wěn)定性，因其它微生物可利用L-蘋果酸為底物進行生長，進而造成葡萄酒腐敗變質(zhì)[3-4]。降解葡萄酒中過量的L-蘋果酸可提高葡萄酒的風(fēng)味品質(zhì)。用于葡萄酒發(fā)酵的釀酒酵母并不能有效降解L-蘋果酸，因此需要采用具有降解蘋果酸能力菌株進行降酸。

一直以來，多采用乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF），將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為L-乳酸，降低葡萄酒酸度、改善葡萄酒感官特性。然而，乳酸菌在葡萄酒的特殊環(huán)境（如低pH值、高SO2、高乙醇、中鏈脂肪酸等）生長和發(fā)酵緩慢[5]，且可能會產(chǎn)生生物胺（如腐胺、組胺、酪胺和尸胺）、氨基甲酸乙酯等有害物質(zhì)[6-8]。MLF結(jié)束后，如果乳酸菌發(fā)酵終止不徹底，葡萄酒可因乳酸菌生長而產(chǎn)生生物渾濁，進而降低葡萄酒品質(zhì)[9]。

實際上，一些非釀酒酵母也可降解L-蘋果酸，利用降酸酵母代替乳酸菌進行降酸發(fā)酵可在某種程度上解決乳酸菌發(fā)酵存在的問題[10-13]。項目組前期已從寧夏賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)區(qū)的自然發(fā)酵赤霞珠葡萄汁中分離了7種，共計299株酵母菌株。為了分析已分離酵母菌降解L-蘋果酸的能力，本研究采用L-蘋果酸降解指示培養(yǎng)基顯色法和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析其降解L-蘋果酸的性能，為葡萄酒降酸提供了新的菌種資源，為酵母菌開發(fā)和利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗所用酵母菌均分離自賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)區(qū)的自然發(fā)酵赤霞珠葡萄酒，見表1。

表1 實驗用酵母菌株Table 1 Yeast strains used in the experiment

1.1.2 試劑

無氨基酵母氮源（yeastnitrogenbasewithoutaminoacids，YNB）、硫酸銨、溴甲酚綠（均為化學(xué)純）、磷酸（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；L-蘋果酸（化學(xué)純）：北京索萊寶科技有限公司；L-蘋果酸（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸粉蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%，蒸餾水配制，121 ℃滅菌20 min。

酵母浸粉蛋白胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose agar，YPDA）培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.5%，蒸餾水配制，121 ℃滅菌20 min。

蘋果酸降解指示培養(yǎng)基：YNB 1.7 g/L，硫酸銨5 g/L，L-蘋果酸20 g/L，溴甲酚綠0.1 g/L，以雙蒸水配制，0.45 μm濾膜過濾除菌。

1.2 儀器與設(shè)備

SZ-93自動雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；HZ200L恒溫搖床：武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；SHZ-D循環(huán)水式多用真空泵：鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌降L-蘋果酸的定性分析

采用蘋果酸降解指示培養(yǎng)基顯色法進行降酸酵母的初篩，參照OSOTHSILP C等[14]的方法。用接種環(huán)取2環(huán)YPDA斜面培養(yǎng)基上的酵母菌，接種到裝液量為30 mL/100 mLYPD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min恒溫搖床培養(yǎng)24 h進行活化?；罨蟮慕湍妇?06CFU/mL接種到裝有30 mL蘋果酸降解指示培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，25 ℃、120 r/min恒溫搖床培養(yǎng)10 d，以空白指示培養(yǎng)基作為對照，每株菌做2個平行。自培養(yǎng)第1天開始每天觀察和記錄培養(yǎng)基的顏色。

培養(yǎng)基中添加L-蘋果酸作為主要碳源，溴甲酚綠作為酸堿指示劑，若待測菌株具有代謝L-蘋果酸的能力，則隨著菌株代謝能力的增強，培養(yǎng)基中L-蘋果酸逐漸被消耗，pH值隨之升高，則培養(yǎng)基的顏色呈現(xiàn)從黃色到藍色的轉(zhuǎn)變，當(dāng)培養(yǎng)基pH 3.3時呈黃色，pH 4.5時開始出現(xiàn)顏色的明顯變化，pH 5.4時呈藍色。

1.3.2 酵母菌降L-蘋果酸的定量分析

根據(jù)GB 5009.157—2006《食品中有機酸的測定》，采用HPLC對蘋果酸降解指示培養(yǎng)基中的蘋果酸含量進行定量檢測，方法如下：

0.1%磷酸溶液配制：磷酸1 mL，加水至1 000 mL并混勻，用0.22 μm濾膜過濾備用。HPLC的流動相為0.1%磷酸溶液和甲醇，二者體積比例為97.5∶2.5。

標(biāo)準(zhǔn)L-蘋果酸溶液配制：準(zhǔn)確稱取L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.5 g，加入0.1%的磷酸溶液并定容至10 mL以配制50 mg/mL蘋果酸的儲備液；然后用0.1%的磷酸溶液稀釋儲備液，分別使L-蘋果酸質(zhì)量濃度達1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和30 mg/mL，于4 ℃保存。

樣品處理：將培養(yǎng)10 d的蘋果酸降解指示培養(yǎng)基倒入50 mL離心管離心10 min（4 ℃、8 000 r/min），取上清并用0.22 μm濾膜過濾并進行檢測。

色譜條件：色譜柱為inertsilODS-3C18柱（4.6 mm×250mm），流動相使用前用超聲波脫氣5 min，總流速0.7 mL/min，檢測波長為210nm，柱溫40℃，進樣量為20μL，檢測時間為20min。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理與分析

采用Microsoft Office 2016和GraphPad Prism 6對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌株降L-蘋果酸的定性分析

為了解不同酵母菌株的L-蘋果酸降解能力，將不同酵母菌按106CFU/mL接種于蘋果酸降解指示培養(yǎng)基，以不接種酵母的空白指示培養(yǎng)基為對照，28 ℃培養(yǎng)10 d，觀察其降酸能力，若酵母培養(yǎng)液呈藍色，則表示其降酸能力強，呈綠色表示其降酸能力較強，呈黃綠色表示其降酸能力弱，若酵母培養(yǎng)液不變色（黃色），則表示其不降酸。顯色結(jié)果表示，304株酵母菌中有21株具有降L-蘋果酸能力的酵母菌株。其中有19株酵母菌降酸能力強，分別是菌株HI-5、HI-6、HII-17、H-II-2、H-II-13、H-II-16、YI-1-1、YI-1-2、YI-2、YI-9-1、YI-9-2、YI-9-3、YII-1、YIII-9、LI-6、LI-9、LI-10、LI-13、L-II-8。菌株G-II-18降酸能力較強，菌株Hlast-35降酸能力弱，而其余菌株均無降酸能力。對降L-蘋果酸的酵母菌株的定性分析結(jié)果表明不同酵母菌株的降酸能力不同。前期研究表明，拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、園球形假絲酵母（Candida sphaerica）、嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）、樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）、解蘋果酸裂殖酵母（Schizosaccharomyces malidevorans）和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）等菌株均具有降解L-蘋果酸的能力，且不同種酵母菌株的降酸能力不同[15-17]。

2.2 L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用高效液相色譜分別分析1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和30 mg/mL的L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。以標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.2523x+1.1093，R2=0.9992，二者線性關(guān)系良好。

圖1 L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of L-malic acid

2.3 酵母菌株降L-蘋果酸的定量分析

為了進一步定量分析不同種酵母菌株的L-蘋果酸降解能力，采用HPLC對發(fā)酵10 d的上清液中L-蘋果酸的含量進行分析，以空白培養(yǎng)基為對照，計算其降酸率。

2.3.1 不同美極梅齊酵母降L-蘋果酸能力的定量分析

不同美極梅齊酵母（Metschnikowia pulcherrima）菌株降酸能力的定量分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株GI-1的降酸率為24.05%，菌株YII-1的降酸率為89.48%，而其他11株M.pulcherrima的降酸率均＞90%，這說明M.pulcherrima菌株均可降解L-蘋果酸，且多數(shù)菌株降酸能力較強。前期研究表明，M.pulcherrima可有效改善葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)。BENITOME等[18]將M.pulcherrima與釀酒酵母序列接種于雷司令葡萄汁中，可顯著提高葡萄酒的果香風(fēng)味。RODRIGUEZ M E等[19]將M.pulcherrima與釀酒酵母序列接種于馬斯喀特葡萄汁中，釀造的葡萄酒中α-松油醇含量增加，提高了葡萄酒的花香風(fēng)味。但關(guān)于降解L-蘋果酸的M.pulcherrima菌株研究尚未見報道。

圖2 不同美極梅齊酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.2 Analysis of L-malic acid degradation ability of different strains of Metschnikowia pulcherrima

2.3.2 不同星形假絲酵母菌株降L-蘋果酸能力的定量分析

圖3 不同星形假絲酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.3 Analysis of L-malic acid degradation ability of different strains of Candida zemplinina

不同星形假絲酵母（Candida zemplinina）菌株降L-蘋果酸能力的定量分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，13株酵母降酸能力均低于30%。然而，APONTE M等[20]在用艾格尼科葡萄進行微發(fā)酵評估時發(fā)現(xiàn)C.zemplinina能產(chǎn)生大量甘油，且能夠代謝所有的果糖和蘋果酸。篩選結(jié)果與文獻報道不符，可能與同種酵母不同菌株之間的降酸差異性不同有關(guān)。

2.3.3 戴爾有孢圓酵母、加利福尼亞假絲酵母及不同庫德畢赤酵母降L-蘋果酸能力的定量分析

戴爾有孢圓酵母（Y-III-2-1）、加利福尼亞假絲酵母（Hlast-35）及不同庫德畢赤酵母（LI-6、LI-13、YI-2）菌株降L-蘋果酸能力的定量分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，戴爾有孢圓酵母的降酸率為6.13%，加利福尼亞假絲酵母的降酸率為34.77%。庫德畢赤酵母（P.kudriavzevii）YI-2的降酸率為85.46%，P.kudriavzeviiLI-6和P.kudriavzeviiLI-13降酸率分別為99.55%及99.21%。事實上，SEO S等[21]從韓國葡萄酒渣中分離到一株具有降解L-蘋果酸的P.kudriavzeviiKMBL 5774，降酸率為95.5%，DEL MóNACO S M等[22]分離出一株降酸菌株P(guān).kudriavzeviiNNI15，且在發(fā)酵過程中高產(chǎn)甘油、低產(chǎn)乙醇，能顯著提高葡萄酒果香。

圖4 戴爾有孢圓酵母、加利福尼亞假絲酵母及不同庫德畢赤酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.4 Analysis of L-malic acid degradation ability of Torulaspora delbrueckii, Candida californica and different strains of Candida zemplinina

2.3.4 不同葡萄有孢漢遜酵母菌株降L-蘋果酸能力的定量分析

不同葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）菌株降L-蘋果酸能力的定量分析結(jié)果見圖5。由圖5可知，菌株G-II-18、L-II-8、H-II-2、H-II-13和H-II-16降解L-蘋果酸能力較強，其降酸率分別為71.20%、86.30%、85.88%、86.62%和81.44%，其余均低于30%。根據(jù)HUK等[23]的報道，將H.uvarum與釀酒酵母序列接種應(yīng)用于黑比諾葡萄酒的釀造，葡萄酒中幾種C13-異戊二烯化合物和一些萜烯物質(zhì)的濃度增加，增加了葡萄酒“熱帶水果”、“漿果”、“花香”和“堅果香”的風(fēng)味特征。HERNANDEZ-ORTE P 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，H.uvarum釋放的糖苷酶能促進萜烯類糖苷的水解，釋放出風(fēng)味活性成分，改善葡萄酒的風(fēng)味品質(zhì)。然而，關(guān)于將H.uvarum應(yīng)用于葡萄酒釀造降解其中L-蘋果酸的研究尚未見報道。

圖5 不同葡萄有孢漢遜酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.5 Analysis of L-malic acid degradation ability of different strains of Hanseniaspora uvarum

2.3.5 不同釀酒酵母菌株降L-蘋果酸能力的定量分析

據(jù)文獻報道，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因不含蘋果酸通透酶而不具有代謝L-蘋果酸的能力[25]，為了驗證鑒定保藏的S.cerevisiae是否具有降酸能力，從鑒定的176株S.cerevisiae隨機選取4株進行降L-蘋果酸定量分析。結(jié)果見圖6。由圖6可知，菌株LIII-7、Glast-33-1、Hlast-2和GIII-16的降酸率分別為5.93%、13.91%、0.86%和12.03%，這說明S.cerevisiae降解L-蘋果酸的能力較低，與文獻報道相符。

圖6 不同釀酒酵母降L-蘋果酸能力的分析Fig.6 Analysis of L-malic acid degradation ability of different strains of Saccharomyces cerevisiae

2.4 不同種酵母降L-蘋果酸能力統(tǒng)計分析

對不同種酵母菌株降L-蘋果酸性能進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表2。由表2可知，不同種酵母菌株降解L-蘋果酸的能力存在明顯差異，即使同一種內(nèi)，不同菌株降解蘋果酸的能力也不盡相同。M.pulcherrima、P.kudriavzevii和H.uvarum中的部分菌株降解蘋果酸能力較強。其中P.kudriavzevii降解蘋果酸的能力較強，而M.pulcherrima和H.uvarum降解蘋果酸的能力則出現(xiàn)了明顯的種內(nèi)差異，產(chǎn)生這個現(xiàn)象的原因還有待探究。此外，在C.zemplinina、T.delbrueckii、C.californica和S.cerevisiae中并未發(fā)現(xiàn)能夠明顯降解L-蘋果酸的菌株。

表2 不同種的酵母菌株降L-蘋果酸能力統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of L-malic acid degradation ability of different yeast species

3 結(jié)論

采用蘋果酸降解指示培養(yǎng)基顯色法和HPLC對自然發(fā)酵液中分離、鑒定的酵母菌株的降解L-蘋果酸能力進行定性和定量分析，共分離到13株強降酸酵母，降酸率均在90%以上。其中菌株HI-5、HI-6、HII-17、LI-9、LI-10、YI-1-1、YI-1-2、YI-9-1、YI-9-2、YI-9-3、YIII-9屬于M.pulcherrima，LI-6、LI-13屬于P.kudriavzevii的。然而不同種酵母菌株間呈現(xiàn)出L-蘋果酸降解能力的明顯差異，且同一種的不同酵母菌株間也存在降酸能力的明顯差異。降L-蘋果酸酵母菌株的獲得為葡萄酒降酸提供新的菌種資源，為酵母菌開發(fā)利用提供借鑒。然而，篩選得到的降解L-蘋果酸的酵母菌株屬于非釀酒酵母，該類酵母發(fā)酵糖產(chǎn)生酒精的能力較弱，所以在用于葡萄酒釀造時，需與釀酒酵母混合發(fā)酵才能同時達到降酸和發(fā)酵產(chǎn)酒的目的[26]，但關(guān)于二者混合發(fā)酵降酸工藝需要進一步探究。