張旭東，莊偉清，李忠磊，劉 薔，劉洪岐，陳代杰，邵 雷，譚 俊*

（1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 201203；2.上海交通大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200240；3.上海健康醫(yī)學(xué)院協(xié)同科研中心，上海 201318）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是1899年由法國學(xué)者TISSIER從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離出的一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌[1]，被廣泛應(yīng)用于牛奶、酸乳、嬰兒配方奶粉、谷物類食品、奶酪和膳食補(bǔ)充劑等食品中[2]，其在調(diào)節(jié)腸道菌群[3]、改善腸道炎癥[4-5]、抗衰老[6]、抗腫瘤[7]和降血脂抗肥胖[8-9]等方面發(fā)揮著重要作用。如雙歧桿菌在人體腸道內(nèi)可產(chǎn)生大量的醋酸，同時(shí)生成乳酸和甲酸，造成腸道內(nèi)的低pH環(huán)境，抑制有害菌和致病菌的生長，并促進(jìn)大腸蠕動，防止下痢和便秘，促進(jìn)人體代謝機(jī)能[10]。

雙歧桿菌是人和動物腸道的優(yōu)勢菌群，影響著人類胃腸道的健康[11]。雙歧桿菌從出生一次性獲得，并終生攜帶，但隨著年齡增長菌群數(shù)量會發(fā)生變化，呈先減少后穩(wěn)定趨勢[12]。成年人腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量處于穩(wěn)定狀態(tài)，老人或胃腸道病人的雙歧桿菌水平較低甚至缺乏[13]。通過服用益生菌活菌產(chǎn)品來補(bǔ)充雙歧桿菌數(shù)量是一種不錯(cuò)的選擇，但是雙歧桿菌必須保證一定的攝入量才能在人體腸道中定殖并發(fā)揮其功能[14]，有研究報(bào)道[15-16]，雙歧桿菌的活菌制劑需要達(dá)到一定的活菌數(shù)才能發(fā)揮益生作用，維持益生功能的最低活菌濃度應(yīng)不低于107CFU/mL。

本研究為篩選出一株具有潛在益生功能的菌株，采用MRS培養(yǎng)基，結(jié)合菌落形態(tài)觀察和16S rDNA基因序列同源性分析，從健康的成人糞便中分離雙歧桿菌。通過7 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)篩選優(yōu)良菌株，并利用該菌株制備發(fā)酵乳，研究其在小鼠體內(nèi)的特性，為雙歧桿菌產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

糞便樣品：采集上海地區(qū)健康成人（18～25歲）6人、性別隨機(jī)、無腸胃病史、1月內(nèi)未服用過抗生素藥品、益生菌的新鮮糞便，立即加入裝有無菌水的燒杯中，用無菌紗布封口轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中，備用，室溫放置不超過2 h。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、牛肉粉、酵母粉（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；脫脂奶粉：恒天然集團(tuán)有限公司；氯化鈉、無水乙酸鈉（均為分析純）：連云港冠蘇實(shí)業(yè)有限公司；氫氧化鈉（分析純）：濟(jì)南英出化工科技有限公司；葡萄糖、碳酸鈉（均為分析純）：西王藥業(yè)有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（分析純）：河南盛之德商貿(mào)有限公司；MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、檸檬酸三銨（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TB GreenTMPremix ExTaqTMII：日本Takara公司；糞便基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基[17]

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉5.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g/L，CH2COONa·3H2O 5.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，pH 6.2。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨3.0 g/L，酵母粉12.5 g/L，葡萄糖6.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，無水乙酸鈉3.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.55 g/L，瓊脂粉18.0 g/L，pH 6.8。121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：即斜面培養(yǎng)基中不加瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：脫脂奶粉80.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，碳酸鈉3.8 g/L，pH 6.8。115 ℃高壓滅菌20 min。

GAM培養(yǎng)基：上海士鋒生物科技有限公司；BBL培養(yǎng)基：杭州百思生物科技有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠（6～8周齡，質(zhì)量（18±2）g）：上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于恒溫恒濕環(huán)境中，自由飲食和飲水，定期滅菌消毒飼養(yǎng)籠。實(shí)驗(yàn)過程中，保持環(huán)境溫度，室內(nèi)光照/黑暗每12 h循環(huán)，飼養(yǎng)溫度21～25 ℃，相對濕度40%～70%。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，相關(guān)手術(shù)操作均嚴(yán)格遵守動物倫理學(xué)原則。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOTECH-7BG發(fā)酵系統(tǒng)：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Concept400M厭氧培養(yǎng)箱：英國Ruskinn公司；AllegraTM 25R低溫高速離心機(jī)：美國BECKMAN公司；E100光學(xué)顯微鏡：日本Nikon公司；DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；CA-500血液自動分析儀：山東蘭橋醫(yī)學(xué)科技有限公司；T100梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；Nano Drop紫外分光光度計(jì)：美國Thermo scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離和純化

稱取糞便4.0 g于20 mL無菌生理鹽水中，使用渦旋混合器充分均化，2 000 r/min下離心10 min并懸浮用作人腸道細(xì)菌混合物。將細(xì)菌混合物用無菌水進(jìn)行梯度稀釋（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），將稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。

挑選大量光滑、邊緣水潤、白色或乳白色的疑似菌落鏡檢，將出現(xiàn)明顯分叉的菌落在GAM固體培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑選出嚴(yán)格厭氧條件下生長的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察，選取革蘭氏陽性菌落，進(jìn)一步分離、純化，直至鏡檢顯示為純菌。

1.3.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

提取分離菌株的DNA，以其為模板，采用特異性引物L(fēng)m26F/Lm3R對菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列分析。將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判定細(xì)菌種類，將細(xì)菌劃分到屬或種。

1.3.3 發(fā)酵乳的制備

取1支工作種子凍存管，取200 μL種子液到新鮮茄子瓶斜面上，涂抹均勻后置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用無菌接種鏟將斜面上的全部菌苔刮落到新鮮的300 mL種子液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按5%（V/V）的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量6 L/7 L，發(fā)酵罐溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵過程pH控制為6.5，當(dāng)補(bǔ)堿瓶中堿液補(bǔ)完后，再繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵液pH降至5.5時(shí)發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液灌裝至無菌瓶里保存。

1.3.4 發(fā)酵乳的活菌檢測

采用平皿澆筑法[19]檢測發(fā)酵乳中的活菌數(shù)：選擇合適稀釋度的菌液，分別取1 mL加入無菌平皿里，然后將室溫的BBL培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，立即混勻至平板凝固。每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，37 ℃倒置厭氧培養(yǎng)24 h，待菌落長好后，計(jì)數(shù)并計(jì)算出原菌液的活菌數(shù)，計(jì)算公式如下：

每毫升原菌液活菌數(shù)（CFU/mL）=同一稀釋度3個(gè)平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.3.5 優(yōu)勢菌株DD98的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將長雙歧桿菌DD98在新鮮斜面上連續(xù)傳代5次，將不同傳代次數(shù)的菌株分別采用MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵（37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h），并對發(fā)酵液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，考察菌種的傳代穩(wěn)定性。

1.3.6 小鼠灌胃方案

90只小鼠隨機(jī)分為3組，每組30只，一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，分別灌胃生理鹽水、發(fā)酵培養(yǎng)基和DD98發(fā)酵乳，灌胃劑量為0.2 mL/只，每天1次，共給藥20 d。在灌胃第0（未灌胃）、5、10、15和20天以及停止灌胃15 d，即第35天時(shí)，每組隨機(jī)選取5只小鼠，處死，解剖取臟器、糞便。此外，對第0、10、20和35天小鼠進(jìn)行眼球取血用于血常規(guī)檢測。

1.3.7 熒光定量PCR法檢測腸道菌群

在無菌環(huán)境下解剖小鼠，冰上操作收集其腸道內(nèi)已成型糞便3～4?；蚪Y(jié)腸內(nèi)容物200～250 mg，保存在-80 ℃超低溫冰箱。分別使用糞便基因DNA提取試劑盒、Nano Drop紫外分光光度計(jì)對腸道內(nèi)容物進(jìn)行提取、純化和濃度測定，并使用無菌水進(jìn)行稀釋。根據(jù)文獻(xiàn)[20-23]方法，設(shè)計(jì)雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和大腸桿菌（Escherichia coli）的特異性引物（見表1），使用熒光定量PCR測定各腸道微生物菌群信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA），熒光定量RCR反應(yīng)體系（10 μL）：SYBR Green Mixture 5 μL，DNA模板1.0 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，雙蒸水（ddH2O）3.0 μL。熒光定量RCR反應(yīng)條件：95 ℃，30 s，循環(huán)1次；95 ℃，5 s，循環(huán)40次；65 ℃，5 s，循環(huán)40次。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3.8 臟器指數(shù)的測定[24-26]

各組小鼠解剖腹部后，摘取其臟器（心、肝、脾、肺、腎），用濾紙吸殘血，稱質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)，計(jì)算公式如下：

臟器指數(shù)=各臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量

1.3.9 血常規(guī)檢測[27-28]

采用阻抗法，在CA-500血液自動分析儀上進(jìn)行血常規(guī)檢測。共檢測8種血常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell count，WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell count，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、血細(xì)胞比容（haematocrit，HCT）、紅細(xì)胞平均體積（meancorpuscularvolume，MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、血小板（platelet，PLT）。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，使用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行相應(yīng)顯著差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及形態(tài)觀察

經(jīng)嚴(yán)格厭氧環(huán)境培養(yǎng)，成功分離到3株疑似雙歧桿菌菌株，編號分別為P-1、P-2和P-3，3株分離菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，3株菌株的菌落形態(tài)無明顯差異，質(zhì)地柔軟、邊緣整齊、表面光滑、有白色或乳白色的凸起。3株菌革蘭氏染色的結(jié)果均為藍(lán)紫色，說明均為革蘭氏陽性菌，與雙歧桿菌染色結(jié)果一致，顯微鏡下觀察到明顯的“V/Y”分支。

圖1 菌株P(guān)-1、P-2和P-3的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colonial (a) and cell (b) morphology of strains P-1,P-2 and P-3

2.2 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

3株分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株P(guān)-1、P-2和P-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains P-1,P-2 and P-3 based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株P(guān)-1、P-2和P-3均與長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）NWAFU002聚于一支，親緣關(guān)系最接近，由此可初步確定這3株菌株均為長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）。

2.3 分離菌株發(fā)酵能力比較

菌株P(guān)-1、P-2和P-3在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵后，測定發(fā)酵乳中的活菌數(shù)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株P(guān)-2制備的發(fā)酵乳中長雙歧桿菌活菌數(shù)最高，可達(dá)2.08×109CFU/mL，而且其發(fā)酵乳活菌數(shù)在消亡期的下降速度較慢。因此，選擇菌株P(guān)-2為優(yōu)勢菌株，命名為DD98，保藏于實(shí)驗(yàn)室，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 菌株P(guān)-1、P-2和P-3制備的發(fā)酵乳中活菌數(shù)檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of viable counts in fermented milk prepared by strains P-1,P-2 and P-3

2.4 菌株DD98遺傳穩(wěn)定性研究

將長雙歧桿菌DD98接種于新鮮斜面上連續(xù)傳代5次，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，活菌計(jì)數(shù)分別為2.17×109CFU/mL、2.06×109CFU/mL、2.12×109CFU/mL、2.23×109CFU/mL、2.11×109CFU/mL，結(jié)果表明，菌株DD98具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.5 菌株DD98發(fā)酵乳體內(nèi)特性研究

2.5.1 熒光定量PCR法分析小鼠腸道菌群

各組小鼠雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、大腸桿菌mRNA表達(dá)量見圖4。由圖4A和4B可知，正常小鼠每日連續(xù)灌胃DD98發(fā)酵乳，在第5、10、15、20天測得的雙歧桿菌、乳桿菌mRNA表達(dá)量均顯著高于灌胃生理鹽水或發(fā)酵培養(yǎng)基組（P＜0.05），說明菌株DD98發(fā)酵乳可以增加正常小鼠胃腸道內(nèi)有益菌的表達(dá)。另外，當(dāng)小鼠停止灌胃15 d后，灌胃菌株DD98發(fā)酵乳的正常小鼠在第35天測得的雙歧桿菌的表達(dá)量仍顯著高于灌胃生理鹽水或培養(yǎng)基組（P＜0.05），說明長期飲用菌株DD98發(fā)酵乳有利于胃腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)目的維持；當(dāng)小鼠停止灌胃15 d后，灌胃菌株DD98發(fā)酵乳的正常小鼠在第35天測得的乳桿菌mRNA表達(dá)量與灌胃生理鹽水或培養(yǎng)基的組無顯著性差異（P＞0.05），說明暫停使用DD98發(fā)酵乳后，乳桿菌的表達(dá)恢復(fù)到了原先的水平。由圖4C和4D可知，正常小鼠每日連續(xù)灌胃菌株DD98發(fā)酵乳，在第5、10、15、20天測得的腸球菌、大腸桿菌mRNA表達(dá)量均顯著低于灌胃生理鹽水或培養(yǎng)基組（P＜0.05），說明菌株DD98發(fā)酵乳可以減少正常小鼠胃腸道內(nèi)有害菌的表達(dá)。另外，當(dāng)小鼠停止灌胃15 d后，灌胃菌株DD98發(fā)酵乳的正常小鼠在第35天測得的腸球菌、大腸桿菌mRNA表達(dá)量與灌胃生理鹽水或發(fā)酵培養(yǎng)基組無顯著性差異（P＞0.05），說明暫停使用菌株DD98發(fā)酵乳后，腸球菌、大腸桿菌的表達(dá)恢復(fù)到了原先的水平。

圖4 各組小鼠雙歧桿菌（A）、乳桿菌（B）、小鼠腸球菌（C）、大腸桿菌（D）mRNA表達(dá)量Fig.4 Expression quantity of mRNA of Bifidobacterium (A), Lactobacillus(B),Enterococcus(C)and Enterobacter(D)of mice in each group

2.5.2 體質(zhì)量及臟器指數(shù)分析

圖5 各組小鼠體質(zhì)量變化Fig.5 Changes of body mass of mice in each group

各組小鼠體質(zhì)量變化見圖5。由圖5可知，隨著時(shí)間的推移，灌胃生理鹽水或發(fā)酵培養(yǎng)基或菌株DD98發(fā)酵乳的小鼠體質(zhì)量均呈上升趨勢且三組小鼠的體質(zhì)量無顯著性差異（P＞0.05），說明灌胃菌株DD98發(fā)酵乳不會影響小鼠生長。

各組小鼠臟器指數(shù)見表2。由表2可知，連續(xù)灌胃菌株DD98發(fā)酵乳0、5、10 d后，正常小鼠臟器指數(shù)與連續(xù)灌胃20 d的生理鹽水或發(fā)酵培養(yǎng)基的正常小鼠的臟器指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）；而在第15天和第20天，與灌胃生理鹽水或發(fā)酵培養(yǎng)基的小鼠相比有顯著性差異（P＜0.05）。停止灌胃15 d，即第35天，灌胃菌株DD98發(fā)酵乳的小鼠也與灌胃生理鹽水或發(fā)酵培養(yǎng)基的小鼠的臟器指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），說明長期灌胃菌株DD98發(fā)酵乳有利于小鼠臟器的生長，對小鼠生長是有益的。

表2 各組小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果Table 2 Determination results of visceral coefficients in different groups of mice

2.5.3 血常規(guī)分析

各組小鼠血常規(guī)值見表3。由表3可知，連續(xù)灌胃20 d，灌胃菌株DD98發(fā)酵乳組正常小鼠血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)值與連續(xù)灌胃20 d的生理鹽水或發(fā)酵培養(yǎng)基的正常小鼠無顯著性差異（P＞0.05）。停止灌胃15 d，即第35天，灌胃菌株DD98發(fā)酵乳組小鼠也與灌胃生理鹽水或發(fā)酵培養(yǎng)基的小鼠的血常規(guī)的各項(xiàng)指標(biāo)無顯著性差異（P＞0.05），說明服用菌株DD98發(fā)酵乳不會對正常小鼠產(chǎn)生不良反應(yīng)。

表3 各組小鼠血常規(guī)值測定結(jié)果Table 3 Determination results of blood routine index of mice in different groups of mice

續(xù)表

3 結(jié)論

本研究采用MRS培養(yǎng)基，結(jié)合菌落形態(tài)觀察和16SrDNA基因序列同源性分析，從健康的成人糞便中分離到3株長雙歧桿菌（P-1、P-2、P-3）并鑒定，其中，菌株P(guān)-2發(fā)酵能力較強(qiáng)，活菌數(shù)最高，遺傳穩(wěn)定較好，被命名為DD98。將菌株DD98作為長雙歧桿菌產(chǎn)品開發(fā)的優(yōu)勢菌株，用于菌株DD98發(fā)酵乳研究。通過正常小鼠體內(nèi)特性研究發(fā)現(xiàn)，服用菌株DD98發(fā)酵乳能顯著增加小鼠胃腸道內(nèi)有益菌、減少有害菌的表達(dá)（P＜0.05），具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。此外，能維持小鼠正常的體質(zhì)量、血常規(guī)指數(shù)，有利于小鼠臟器的生長，這對菌株DD98產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。