何 雷,徐金升,白亞玲,張慧然,周 薇,張勝雷,劉 蘭,張彤彤

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科,石家莊 050011;*通訊作者,E-mail:xjs5766@126.com)

血管鈣化(vascular calcification,VC)與心血管疾病和慢性腎臟病患者的死亡率有關(guān)[1],且在慢性腎臟病患者全因死亡率中占第一位[2]。血管鈣化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及不同的分子途徑,而血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)在血管鈣化的形成和發(fā)展中具有重要的作用[3,4]。研究顯示,VSMCs鈣化與成骨信號(hào)通路有關(guān)[5],此外,成骨信號(hào)通路和VC的主要特征是核心轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的特異性上調(diào)[6]。研究發(fā)現(xiàn),miRNAs通過(guò)參與VSMCs向成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,進(jìn)而參與血管鈣化[7]。miR-103是miR-15/107家族的一員,在人體組織中廣泛表達(dá)[8]。miRNAs數(shù)據(jù)庫(kù)基因預(yù)測(cè)分析miR-103參與血管鈣化的發(fā)生發(fā)展。且已有報(bào)道顯示,miR-103能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[9]。我們推測(cè)miR-103在細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中起一定作用,進(jìn)而影響血管鈣化。為此,本研究以體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs為研究對(duì)象,探討miR-103在高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化發(fā)生過(guò)程中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

β-甘油磷酸購(gòu)自Sigma公司;DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司;RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Thermo Fisher公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購(gòu)自廣州易錦公司;miR-103的類似物與抑制物購(gòu)自銳博公司;茜素紅S染料購(gòu)自Solarbio公司;堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司;鈣含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司;堿Runx2抗體購(gòu)自Abcam公司;GAPDH抗體購(gòu)自Bioworld公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽渑c分組

取4周齡、體質(zhì)量約80-100 g的清潔級(jí)雄性健康SD大鼠(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證編號(hào):1305090)。體外分離大鼠胸主動(dòng)脈,并將血管剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊,采用組織貼壁法,將組織塊貼于瓶底,進(jìn)行原代培養(yǎng),傳代至第3-4代,將細(xì)胞分為正常組和高磷組(給予10 mmol/L β-甘油磷酸鹽,HP組),刺激4 d后,檢測(cè)VSMCs的鈣化情況、ALP活性,及miR-103和Runx2的表達(dá)情況。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-103對(duì)VSMCs的作用,分為6組:正常組,完全培養(yǎng)基;NC inhibitor組,轉(zhuǎn)染抑制物的對(duì)照NC inhibitor;miR-103 inhibitor組,轉(zhuǎn)染抑制物miR-103 inhibitor;高磷組(HP),高磷環(huán)境細(xì)胞未轉(zhuǎn)染;NC mimic+HP組,高磷環(huán)境轉(zhuǎn)染類似物的對(duì)照(NC mimic);miR-103 mimic+HP組,高磷環(huán)境轉(zhuǎn)染類似物miR-103 mimic。轉(zhuǎn)染后72 h,測(cè)定VSMCs的鈣化情況、ALP活性,及miR-103和Runx2的表達(dá)情況。

1.3 茜素紅鈣化染色

將12孔板內(nèi)培養(yǎng)的第3代VSMCs給予干預(yù)后棄去上清,用95%乙醇室溫固定20-30 min,茜素紅染液(pH8.4,濃度為0.1%)染色1 h,倒置顯微鏡下觀察并記錄。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):橘紅色結(jié)節(jié)為鈣鹽沉積。

1.4 細(xì)胞鈣含量測(cè)定

12孔板內(nèi)培養(yǎng)的VSMCs給予干預(yù)后棄去上清,加入1 mol/L的鹽酸37 ℃脫鈣過(guò)夜,取上清液,使用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測(cè)定鈣含量,細(xì)胞用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液和0.1%十二烷基硫酸鈉溶解30 min,使用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白質(zhì)含量,結(jié)果用蛋白含量校準(zhǔn)(mg/g蛋白)。

1.5 ALP活性測(cè)定

將培養(yǎng)的VSMCs棄上清,磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次,加入1%聚乙二醇辛基苯基醚生理鹽水,置于4 ℃冷藏24 h后離心,取上清液,測(cè)定其活性,結(jié)果用蛋白質(zhì)校準(zhǔn)(U/g)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)Runx2表達(dá)

提取刺激后VSMCs的miRNA和mRNA,測(cè)定miRNA及Runx2的表達(dá)。miR-103及5s引物由銳博公司提供,5s為內(nèi)參,反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 10 min;變性95 ℃ 10 s;退火60 ℃ 20 s;延伸72 ℃ 10 s。Runx2 mRNA PCR引物由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì),引物序列見(jiàn)表1。GAPDH為內(nèi)參,反應(yīng)條件:即預(yù)變性95 ℃ 10 min;變性95 ℃ 20 s;退火60 ℃ 30 s;延伸72 ℃ 20 s。記錄數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.7 Western印跡法檢測(cè)VSMCs目的蛋白表達(dá)

提取各組細(xì)胞蛋白,測(cè)定Runx2蛋白的表達(dá)。取50 μg蛋白質(zhì)加入10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中,恒壓95 V電泳1.5 h,恒壓95 V轉(zhuǎn)膜1 h,牛奶封閉1 h,加入一抗稀釋液(Runx2 1∶500,GAPDH 1∶5 000),4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗膜,放入二抗稀釋液(1∶5 000),室溫下孵育1 h,于蛋白成像儀上顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高磷可以引起VSMCs鈣化增加

2.1.1 VSMCs茜素紅染色及鈣含量測(cè)定 茜素紅染色顯示,高磷組較正常組的橘紅色鈣化結(jié)節(jié)顯著增多;鈣含量結(jié)果顯示,高磷組VSMCs的鈣含量顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

圖1 兩組VSMCs鈣化的表達(dá)情況

2.1.2 高磷引起大鼠VSMCs Runx2表達(dá)升高和ALP活性增加 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western結(jié)果顯示,與正常組比較,給予β-GP干預(yù)后,高磷組Runx2 mRNA及蛋白表達(dá)均升高(P<0.05),ALP活性顯著增強(qiáng)(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

與正常組比較,*P<0.05

2.2 高磷引起大鼠VSMCs miR-103表達(dá)降低

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,與正常組比較,給予β-GP干預(yù)后,高磷組的miR-103的表達(dá)顯著下降(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與正常組比較,*P<0.05

2.3 miR-103導(dǎo)致VSMCs鈣化降低

2.3.1 miR-103對(duì)VSMCs茜素紅染色及鈣含量測(cè)定的影響 茜素紅染色顯示,與NC inhibitor組比較,miR-103 inhibitor組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)顯著增多,鈣離子含量顯著升高(P<0.05);與NC mimic+HP組相比,miR-103 mimic+HP組的橘紅色鈣結(jié)節(jié)顯著減少,鈣離子含量顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

與正常組或高磷組比較,*P<0.05;與相應(yīng)的NC組比較,#P<0.05

2.3.2 miR-103導(dǎo)致VSMCs Runx2表達(dá)降低和ALP活性降低 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡結(jié)果顯示,與NC inhibitor組比較,miR-103 inhibitor組的Runx2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與NC mimic+HP組比較,miR-103 mimic+HP組的Runx2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖5)。ALP活性測(cè)定結(jié)果顯示:與NC inhibitor組比較,miR-103 inhibitor組的ALP活性顯著升高(P<0.05);與NC mimic+HP組比較,miR-103 mimic+HP組的ALP活性顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

與正常組或高磷組比較,*P<0.05;與相應(yīng)的NC組比較,#P<0.05

與正常組或高磷組比較,*P<0.05;與相應(yīng)的NC組比較,#P<0.05

3 討論

血管鈣化是慢性腎臟病患者心血管疾病發(fā)病率高的主要原因[10]。高磷血癥是導(dǎo)致血管中膜鈣化的重要危險(xiǎn)因素,VSMCs是血管中膜的重要組成成分[11]。研究表明,VSMCs鈣化發(fā)生的重要機(jī)制之一是VSMCs的表型轉(zhuǎn)化[5]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)原代大鼠VSMCs,發(fā)現(xiàn)高磷可誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生鈣化,可能是通過(guò)抑制miR-103表達(dá),促進(jìn)了VSMCs表型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)了VSMCs鈣化。

鈣磷代謝紊亂時(shí),VSMCs由收縮表型轉(zhuǎn)化為成骨/軟骨細(xì)胞樣表型來(lái)介導(dǎo)血管鈣化[12]。成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2和礦化調(diào)節(jié)蛋白ALP的特異性上調(diào)是成骨和VC的主要特征。因此Runx2是VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志,而ALP是血管鈣化發(fā)生的經(jīng)典生物標(biāo)志物[13,14]。本研究證明了給予高磷刺激,可以誘導(dǎo)VSMCs鈣化,促進(jìn)Runx2表達(dá),增加ALP活性,提示高磷可以誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而引起VSMCs鈣化。

有研究證明miRNAs通過(guò)參與血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化而參與血管鈣化[6]。miR-103屬于miR-15/107家族,是一種進(jìn)化保守的miRNA,在人體正常組織中廣泛表達(dá),并參與癌癥及炎癥等疾病的發(fā)展[15]。研究顯示,miR-103可負(fù)性調(diào)節(jié)SATB同源盒2,抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化[16]。本研究顯示高磷環(huán)境,miR-103表達(dá)下調(diào),提示高磷環(huán)境可抑制miR-103表達(dá)。為進(jìn)一步證明miR-103對(duì)VSMCs的影響,本研究在VSMCs中給予了轉(zhuǎn)染miR-103的類似物與抑制物。結(jié)果顯示,給予miR-103抑制物后VSMCs鈣化增加,且Runx2表達(dá)和ALP活性均升高;高磷環(huán)境給予miR-103類似物后VSMCs鈣化減低,且Runx2表達(dá)和ALP活性均顯著降低。進(jìn)一步證明了miR-103可負(fù)向調(diào)節(jié)Runx2表達(dá),在VSMCs鈣化過(guò)程中起抑制作用。

綜上所述,高磷可誘導(dǎo)VSMCs鈣化,可能機(jī)制之一是高磷通過(guò)抑制VSMCs中miRNA-103表達(dá),促進(jìn)Runx2表達(dá),從而誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)VSMCs鈣化的發(fā)生。