姜玉玉,尹天玥,李小雨,于 汝,程向陽

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:yxhyhr@163.com)

冠心病常伴心臟缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)損傷,是引起心力衰竭的主要原因之一[1-3]。既往對心肌I/R損傷發(fā)病機制的研究多集中在氧自由基、鈣超載、炎癥反應、線粒體損傷、內皮細胞損傷等方面[4]。近年來,為了防止I/R損傷,一些藥理學策略被廣泛研究[5,6]。

凋亡已被發(fā)現(xiàn)是心肌I/R損傷的基礎[7],心肌缺血后不久即開始凋亡過程,再灌注時凋亡明顯增強[8]。由于心肌細胞是沒有或幾乎沒有再生潛能的終末分化細胞,因此防止心肌細胞在I/R損傷后的凋亡是一項重要的臨床治療策略。

右美托咪定是一種選擇性α2腎上腺素受體激劑,具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用,被廣泛應用于臨床麻醉[9,10]。右美托咪定在神經保護方面具有潛在的應用前景,此外,它還對于很多器官,包括肝、肺、腎和心肌都有保護作用[11]。右美托咪定預處理保護了心肌細胞免受I/R損傷[12],然而其保護機制需要進一步研究。

miRNA是一類長度約為22 bp的非編碼小RNA,可以通過結合mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)抑制基因表達[13]。越來越多的數據表明,miRNA表達異常與多種心血管疾病有關,包括心肌I/R損傷[14]。MiR-579-3p在多種腫瘤中均低表達。miR-579-3p低表達與腫瘤的發(fā)生密切相關[15]。一項動物腦I/R損傷模型報道,miR-579-3p可通過抑制炎癥和細胞凋亡,部分減輕腦I/R損傷[16]。

因此我們推測,調控miR-579-3p可能是右美托咪定減輕心肌I/R損傷的機制。本研究通過建立心肌細胞缺氧復氧損傷模型,研究右美托咪定對心肌I/R損傷的影響,以及右美托咪定減少心肌I/R損傷與miR-579-3p之間的關系。

1 材料與方法

1.1 主要材料

miR-579-3p inhibitor、miR-579-3p inhibitor NC(miR-579-3p inhibitor空白對照)、miR-579-3p引物購自上海吉瑪公司;Lipofectamine購自美國Invitrogen公司;DMEM/F12培養(yǎng)基,胎牛血清購自Gibco公司;Ⅱ型膠原酶購自北京Solarbio公司;CCK-8檢測試劑盒,Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物公司;PVDF膜購自美國Millipore公司;兔源抗Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3抗體購自美國Affinity公司;兔源抗GAPDH抗體,HRP標記的羊抗兔二抗購自Biosharp公司。

1.2 動物

1-3 d SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠購自蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心,合格證號:20180004002485。

1.3 細胞培養(yǎng)

取1-3 d的乳鼠頸椎脫臼處死,75%酒精消毒60 s,取出乳鼠的心臟,以預冷D-Hanks液清洗3次,剪碎,用含有0.07%胰蛋白酶和0.08%Ⅱ型膠原酶的混合酶37 ℃消化5 min,沉淀1 min后,取消化后的細胞上清液置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中終止消化,消化過程約5次。含細胞上清液的DMEM/F12培養(yǎng)基1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基混勻,收集細胞懸液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁90 min,吸取細胞懸液,接種于另一培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)24 h后換液。待細胞密度約60%時,建立心肌細胞缺氧/復氧模型。棄去培養(yǎng)基,更換為不含胎牛血清的無糖DMEM培養(yǎng)基,在1%O2和5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中缺氧6 h后,置換含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,并于5%CO2,95%空氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h進行復氧處理。

1.4 細胞處理與分組

為了確定不同濃度右美托咪定對缺氧復氧刺激后心肌細胞活性的影響,我們在缺氧復氧時分別給予0.01,0.1,1 μmol/L右美托咪定處理。

為檢測右美托咪定對心肌細胞缺氧復氧的影響,將細胞隨機分為5組:①control組在完全培養(yǎng)基中,37 ℃,5%CO2,常氧條件下培養(yǎng)12 h。②H/R組用無糖培養(yǎng)基替代完全培養(yǎng)基,在37 ℃,5%CO2、94%N2,1%O2條件培養(yǎng)6 h,隨后替換完全培養(yǎng)基,37 ℃,5%CO2,常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h。③H/R+Dex組進行1 μmol/L右美托咪定給藥后缺氧復氧處理。④H/R+Dex+NC組在轉染miR-579-3p inhibitor NC 24 h后,進行右美托咪定給藥和缺氧復氧處理。⑤H/R+Dex+inhibitor組在轉染miR-579-3p inhibitor 24 h后,進行右美托咪定給藥和缺氧復氧處理。

1.5 qRT-PCR檢測miR-579-3p表達

使用Trizol試劑提取各組細胞總RNA,定量后吸取1 μg總RNA產物,采用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板,使用StepOne Plus熒光定量PCR系統(tǒng)和SYBR Green試劑盒進行qRT-PCR測定miR-579-3p表達。以U6作為內參。引物序列見表1。

表1 miRNA引物序列

1.6 CCK-8實驗檢測心肌細胞活力

將心肌細胞消化并重懸,接種于96孔板(1×104個細胞/孔),每組3個復孔。經上述處理后,每孔分別加入CCK-8試劑10 μl,37 ℃孵育1 h。測定450 nm處吸光度值。

1.7 細胞凋亡檢測

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。各組細胞經相應處理后,收集細胞,用1×結合緩沖液重懸細胞。將細胞懸液調整為1×106/ml。加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl碘化丙啶(PI),輕輕混勻,室溫(20-25 ℃)避光孵育15 min。使用FACSCaliburTM分析各組細胞凋亡所占百分比。

1.8 Western blot檢測Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白的表達

各組細胞經過不同處理后,收集細胞,在含苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的RIPA裂解液中冰上裂解30 min,12 000 r/min離心15 min,收集上清作為細胞總蛋白。分別將等質量的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、5%脫脂牛奶封閉,孵育一抗,包括Bcl-2(1∶1 000),Bax(1∶1 000),cleaved Caspase-3(1∶1 000),GAPDH(1∶3 000),4 ℃孵育過夜。然后,用TBST洗膜,室溫孵育HRP標記的羊抗兔二抗(1∶10 000)1 h,使用ECL進行顯影,放入成像系統(tǒng)進行曝光。用ImageJ軟件分析免疫反應條帶密度,GAPDH作為內參。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 右美托咪定對缺氧復氧誘導的心肌細胞活性的影響

與control組相比,H/R組心肌細胞活性顯著降低(P<0.05);與H/R組相比,H/R+0.1 μmol/L Dex組細胞活力顯著增加(P<0.05);與H/R組相比,H/R+1 μmol/L Dex組細胞活力顯著增加(P<0.05),與H/R+0.1 μmol/L Dex組相比,H/R+1 μmol/L Dex組細胞活力增加(見圖1),因此以1 μmol/L濃度的右美托咪定進行后續(xù)實驗。

與control組相比,*P<0.05;與H/R組相比,#P<0.05

2.2 右美托咪定對缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡的影響

流式細胞術結果表明,與control組相比,H/R組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),而與H/R組相比,H/R+Dex組凋亡率明顯下降(P<0.05,見圖2)。Western blot結果顯示,與control組相比,H/R組Bcl-2降低,Bax,cleaved Caspase-3升高(P<0.05),而與H/R組相比,H/R+Dex組Bcl-2升高,Bax,cleaved Caspase-3降低(P<0.05,見圖2)。

與control組相比,**P<0.01;與H/R組相比,#P<0.05,##P<0.01

2.3 右美托咪定對H/R處理后心肌細胞中miR-579-3p表達的影響

與control組相比,H/R組miR-579-3p表達顯著降低(P<0.01);與H/R組相比,H/R+Dex組miR-579-3p表達升高(P<0.05,見圖3)。此外,轉染miR-579-3p inhibitor結果提示,與NC組相比,inhibitor組miR-579-3p表達顯著降低(P<0.01,見圖3)。

與control組相比,*P<0.05;與H/R組相比,#P<0.05與NC組相比,**P<0.01

2.4 右美托咪定通過提高miR-579-3p表達緩解心肌細胞缺氧復氧損傷

流式細胞術結果表明,與H/R組相比,H/R+Dex組凋亡率明顯降低(P<0.01);與H/R+Dex組相比,H/R+Dex+inhibitor組凋亡率顯著升高(P<0.05,見圖4)。Western blot結果表明,與H/R組相比,H/R+Dex組Bcl-2升高,Bax,cleaved Caspase-3降低(P<0.05);與H/R+Dex組相比,H/R+Dex+inhibitor組Bcl-2降低,Bax,cleaved Caspase-3表達升高(P<0.05,見圖4)。

與H/R組相比,**P<0.01;與H/R+Dex組相比,#P<0.05,##P<0.01

3 討論

右美托咪定用于重癥監(jiān)護病房和手術室手術前或手術期間的麻醉和鎮(zhèn)靜。越來越多的證據表明右美托咪定在許多病理過程中,特別是在缺血/再灌注損傷中,對器官發(fā)揮保護作用。在心血管系統(tǒng),體內和體外大鼠心臟I/R模型中,右美托咪定預處理可顯著改善缺血后心肌功能,降低心肌梗死面積[11-17]。凋亡是I/R損傷過程中的關鍵事件,在其發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用[18]。miRNA在轉錄后水平調控約60%基因表達,并在缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[19]。miRNA在缺血刺激反應中的作用逐漸成為缺血后心肌保護和恢復的靶點。miR-579-3p在腦I/R損傷中具有抗凋亡作用,因此,我們猜測其在心肌I/R損傷中也可能具有類似作用。為因此,我們建立了心肌細胞缺氧復氧模型研究miR-579-3p在心肌I/R損傷中的作用。在這個模型中,細胞被放置在一個低氧環(huán)境中數小時后返回到常氧環(huán)境,這可以模擬心肌I/R損傷,對于研究心肌損傷是一個有用的工具[20]。

本研究結果顯示,與H/R組相比,H/R+Dex組Dex預處理不僅提高了miR-579-3p表達,而且也增加了心肌細胞活性,說明右美托咪定可以改善缺氧復氧后心肌細胞活力,降低心肌細胞凋亡,這與之前的研究結果一致。本研究結果表明,與H/R+Dex組相比,H/R+Dex+inhibitor組通過降低miR-579-3p表達,從而降低了心肌細胞活性。提示右美托咪定的心肌細胞保護作用可能是通過提高miR-579-3p表達實現(xiàn)的。這些結果可能對于減少包括I/R損傷在內的心臟綜合征具有重要的臨床意義。

綜上所述,右美托咪定可以減輕原代心肌細胞H/R損傷,而其保護作用可能是通過升高miR-579-3p表達,抑制凋亡實現(xiàn)的。其在臨床中的應用還需要進一步的研究來證實。