李 妘,王 靜

(1陜西省漢中市中心醫(yī)院婦科,漢中 723000;2陜西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科;*通訊作者,E-mail:yanghua422196@163.com)

宮頸癌(cervical cancer,CC)是一種常見的婦科惡性腫瘤,在女性癌癥相關(guān)死亡疾病中,排名第4位[1]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,2018年全世界診斷宮頸癌新發(fā)病例569 847例,死亡病例311 365例[2]。目前,臨床上宮頸癌的主要治療手段包括手術(shù)、放療及化療,順鉑是臨床上治療宮頸癌的一線化療藥物,然而由于耐藥性的產(chǎn)生,大多數(shù)患者預(yù)后仍不樂觀[3,4]。微小RNA(microRNAs,miRNA)是一類小的非編碼RNA,其通過結(jié)合抑制靶信使RNA(mRNAs)的3'非翻譯區(qū)(UTR)在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5]。目前,已有研究表明,miR-218、miR-501、miR-1284可通過調(diào)節(jié)其下游基因在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥中發(fā)揮重要功能[6-10]。但是,miR-10a-5p在宮頸癌中的功能及作用機(jī)制是怎樣的目前研究甚少?；诖?本研究對(duì)miR-10a-5p在宮頸癌細(xì)胞的增殖及對(duì)順鉑化療敏感性的影響進(jìn)行了研究,研究假設(shè)miR-10a-5p參與宮頸癌細(xì)胞的增殖及對(duì)順鉑化療敏感性的影響,其作用機(jī)制可能與靶向交叉蛋白1(intersectin 1,ITSN1)相關(guān)。本研究對(duì)此假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證,以期為宮頸癌的發(fā)生發(fā)展提供更深入的了解。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究所用到的23對(duì)宮頸癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本均收集于2019年1月至2019年12月入住我院婦科經(jīng)病理確診為宮頸癌的患者。

1.2 材料和主要試劑

人宮頸癌細(xì)胞株Caski購自中國科學(xué)院細(xì)胞研究所(中國上海);實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)試劑盒購自廣州銳博生物有限公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司;順鉑(凍干型)購自齊魯制藥(海南)有限公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁公司;GAPDH、ITSN1抗體及山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司;ECL發(fā)光液購自上海翊圣生物科技有限公司;過表達(dá)miR-10a-5p慢病毒及試劑盒購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司;空載質(zhì)粒、ITSN1野生型3′-UTR實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒、突變型3′-UTR實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒、miR-10a-5p-mimics及miR-10a-5p-NC購自長(zhǎng)沙博楚生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(其中包含1%的青霉素+鏈霉素)培養(yǎng)人宮頸癌Caski細(xì)胞株,將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度設(shè)定為37 ℃,CO2濃度設(shè)置為5%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞感染及分組

按密度為5×104個(gè)/ml將Caski細(xì)胞株重懸于感染增強(qiáng)液中,接種于24孔板中(每種細(xì)胞株均設(shè)置3個(gè)副孔),每孔體積為1 ml,在其中兩孔中,按MOI=10,分別加入空載體病毒(陰性對(duì)照組)或miR-10a-5p過表達(dá)慢病毒(miR-10a-5p過表達(dá)組)混合液各2.5 μl,另一孔不做處理(空白對(duì)照組)。將24孔板放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-16 h,進(jìn)行培養(yǎng)基更換,后將細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)及傳代,以2 μg/ml濃度的嘌呤霉素篩選得到過表達(dá)及空載體病毒轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞株,用于后續(xù)研究。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)患者組織及宮頸癌細(xì)胞中miR-10a-5p的表達(dá)

采用RNA抽提試劑盒提取患者腫瘤組織、配對(duì)的癌旁正常組織總RNA及空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、過表達(dá)組宮頸癌細(xì)胞總RNA,采用qRT-PCR檢測(cè)組織、細(xì)胞中miR-10a-5p和三組細(xì)胞中ITSN1 mRNA表達(dá)水平,對(duì)于miR-10a-5p和RNA基因ITSN1,分別按照miDETECT A TrackTM、miRNA qRT-PCR、Starter Kit和riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit說明書要求加入各組分試劑,按照說明書設(shè)置反應(yīng)條件,先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA文庫,后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列見表1。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 引物序列

1.6 Western blot檢測(cè)ITSN1蛋白表達(dá)水平

取1.4中三組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,收集細(xì)胞,加入蛋白裂解液和PMSF,離心后上清液即為所需蛋白,利用BCA蛋白定量試劑盒,采用BCA法進(jìn)行細(xì)胞蛋白濃度定量。然后,使用10%的十二烷基硫酸鈉聚烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)進(jìn)行電泳反應(yīng),隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜反應(yīng),轉(zhuǎn)膜后使用脫脂牛奶室溫進(jìn)行封閉1 h,隨后加入1∶1 000稀釋的一抗兔ITSN1抗體,于4 ℃孵育過夜,以洗膜緩沖液(Tris buffered saline tween,TBST)清洗3遍,每遍10 min,于室溫孵育二抗-山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)1.5 h;以TBST清洗3遍,每遍10 min。進(jìn)行曝光顯影。

1.7 CCK-8檢測(cè)miR-10a-5p對(duì)細(xì)胞增殖及對(duì)順鉑藥物敏感性的影響

取1.4中三組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,接種于96孔板,接種濃度為5×103個(gè)/孔,每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,每種細(xì)胞共接種于5塊板中,接種后第0,1,2,3,4天,于每孔加入10 μl的CCK-8溶液,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h后,使用吸光分度儀,設(shè)置參數(shù)波長(zhǎng)為450 nm,測(cè)定吸光度;取上述三組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,接種于96孔板,接種濃度為5×104個(gè)/孔,每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,每種細(xì)胞共接種于5塊板中,每塊板分別加入配置好的順鉑溶液,使其濃度為0.4,0.8,1.2,1.6,2 μg/L,培養(yǎng)48 h后,于每孔加入10 μl的CCK-8溶液,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3h后,使用吸光分度儀,設(shè)置參數(shù)波長(zhǎng)為450 nm,測(cè)定吸光度后進(jìn)行計(jì)算。

1.8 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及核心基因篩選

基于TargetScan數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/)對(duì)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),得到miRNA對(duì)應(yīng)的所有靶基因,然后根據(jù)miRNA與基因的靶向調(diào)控關(guān)系構(gòu)建miRNA調(diào)控基因的網(wǎng)絡(luò)圖,并通過網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出miRNA調(diào)控的核心基因。

1.9 雙熒光素酶活性檢測(cè)

宮頸癌細(xì)胞株Caski質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48 h后,檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性。向各孔中加入75 μl Dual-Glo@螢火蟲熒光素酶試劑,混合均勻。10 min后,使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)讀數(shù),檢測(cè)螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度RLU1;之后每孔添加75 μl Dual-Glo@Stop&Glo檢測(cè)試劑,10 min后用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)讀數(shù),檢測(cè)內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度RLU2。計(jì)算兩組數(shù)據(jù)比值(RLU1/RLU2),RLU1/RLU2比值可反映質(zhì)粒熒光素酶的相對(duì)表達(dá)活性即細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-10a-5p在宮頸癌組織中低表達(dá)

通過qRT-PCR檢測(cè)23對(duì)宮頸癌及配對(duì)的癌旁正常組織發(fā)現(xiàn),癌旁組織中miR-10a-5p表達(dá)量顯著高于癌組織(14.38±0.237 2vs9.973±0.560 2,P=0.000 2,見圖1)。

與癌旁正常組織相比,*P<0.05

2.2 穩(wěn)定高表達(dá)miR-10a-5p Caski細(xì)胞系篩選

研究通過慢病毒感染Caski細(xì)胞,嘌呤霉素篩選后成功獲得穩(wěn)定高表達(dá)miR-10a-5p的Caski細(xì)胞系。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組相比,過表達(dá)組細(xì)胞中miR-10a-5p表達(dá)顯著增高(1±0vs2.548±0.014),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1),與陰性對(duì)照組相比,過表達(dá)組細(xì)胞中miR-10a-5p表達(dá)顯著增高(0.96±0.011vs2.548±0.014,P<0.000 1),而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,細(xì)胞miR-10a-5p表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.912,見圖2)。

與空白對(duì)照組相比,*P<0.05;與陰性對(duì)照組相比,#P<0.05

2.3 過表達(dá)miR-10a-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在第4天,與空白對(duì)照組相比,miR-10a-5p過表達(dá)組吸光度明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1),與陰性對(duì)照組相比,miR-10a-5p過表達(dá)組吸光度明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002 6),而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比細(xì)胞吸光度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.2,見圖3)。通過以上數(shù)據(jù)可以得出miR-10a-5p能夠明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。

與空白對(duì)照組相比,*P<0.05;與陰性對(duì)照組相比,#P<0.05

2.4 過表達(dá)miR-10a-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞化療藥物敏感性影響

與空白對(duì)照組相比,miR-10a-5p過表達(dá)組細(xì)胞在順鉑濃度為2.0 μg/L時(shí)處理后的生長(zhǎng)抑制率明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與陰性對(duì)照組相比,miR-10a-5p過表達(dá)組細(xì)胞在順鉑濃度為2.0 μg/L時(shí)處理后的生長(zhǎng)抑制率明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4),提示過表達(dá)miR-10a-5p能夠增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。

與空白對(duì)照組相比,*P<0.05;與陰性對(duì)照組相比,#P<0.05

2.5 三組間ITSN1的mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

相對(duì)于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組,miR-10a-5p過表達(dá)組細(xì)胞ITSN1蛋白表達(dá)水平明顯降低(見圖5A)。相對(duì)于空白對(duì)照組,miR-10a-5p過表達(dá)組細(xì)胞ITSN1mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),相對(duì)于陰性對(duì)照組,miR-10a-5p過表達(dá)組細(xì)胞ITSN1mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),而陰性對(duì)照組細(xì)胞ITSN1 mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P=0.2,見圖5B)。通過以上數(shù)據(jù)可以得出miR-10a-5p能夠明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。

圖5 Western blot和qRT-PCR檢測(cè)三組細(xì)胞中ITSN1蛋白和mRNA水平

2.6 miR-10a-5p通過靶向作用ITSN1 3′-UTR抑制ITSN1表達(dá)

TargetScan軟件預(yù)測(cè)到miR-10a-5p與其靶基因ITSN1 3′-UTR的結(jié)合位點(diǎn)(見圖6A)。通過構(gòu)建ITSN1 3′-UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與突變質(zhì)粒,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-10a-5p是目的基因ITSN1啟動(dòng)子區(qū)DNA的作用位點(diǎn)(見圖6B)。

圖6 miR-10a-5p通過靶向ITSN1 3′UTR抑制ITSN1的表達(dá)

3 討論

宮頸癌為常見的婦科腫瘤,每年有數(shù)十萬的新增病例,嚴(yán)重?fù)p害了患者的身心健康[2]。同步放化療是針對(duì)晚期宮頸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療策略[11]。但是,耐藥性的產(chǎn)生使臨床治療效果并不理想。因此,闡明耐藥的潛在機(jī)制,尋求宮頸癌的潛在治療靶標(biāo)至關(guān)重要。眾所周知,miRNA與包括宮頸癌、乳腺癌和膀胱癌在內(nèi)的多種疾病的進(jìn)展和耐藥性相關(guān)[12]。有研究表明,miR-218可以通過直接下調(diào)IDO1進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的免疫逃逸反應(yīng)[8]。miR-501可以通過靶向CYLD來促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[9]。miR-1284可通過靶向HMGB1增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[10]。此外,miRNA也被認(rèn)為是腫瘤的治療靶點(diǎn)[13]。文獻(xiàn)報(bào)道,在非小細(xì)胞肺癌中,miR-10a-5p可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性并且可用于臨床診斷[14]。通過抑制miR-10a-5p靶向TFAP2C可以降低人類胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的遷移和侵襲能力,在腫瘤的發(fā)生和耐藥中起重要作用[15]。本研究通過對(duì)宮頸癌及配對(duì)的癌旁組織檢測(cè),發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p在宮頸癌組織中的表達(dá)低于癌旁配對(duì)正常組織,這提示miR-10a-5p可能參與調(diào)控宮頸癌的發(fā)生。本研究通過慢病毒感染的方法構(gòu)建miR-10a-5p過表達(dá)細(xì)胞株,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞株中,具有抑制腫瘤增殖及增加順鉑化療敏感性的影響。文獻(xiàn)報(bào)道,miRNA可以通過特異性調(diào)控靶基因ITSN1,在多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用[16,17]。ITSN1是一種細(xì)胞銜接蛋白,主要參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞胞吐、細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過程[18]。在乳腺癌中,過表達(dá)ITSN1可通過調(diào)節(jié)Ki67和Caspase-3的表達(dá)水平來抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。ITSN1-L可通過FAK/整合素β3途徑減弱細(xì)胞與基底的黏附抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤進(jìn)展[20]。根據(jù)靶基因預(yù)測(cè)分析,我們發(fā)現(xiàn)ITSN1為miR-10a-5p的靶基因,并且進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定ITSN1可以與miR-10a-5p結(jié)合。

綜上所述,miR-10a-5p在宮頸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織,過表達(dá)miR-10a-5p可以明顯降低宮頸癌細(xì)胞的增殖能力,并且增強(qiáng)了對(duì)化療藥物順鉑的藥物敏感性,其作用機(jī)制可能是通過靶向ITSN1發(fā)揮作用的。以上研究提示miR-10a-5p可能為宮頸癌的潛在治療靶點(diǎn),但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。