王 林,王 媚,王 維

(1西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,西安 710002;2西北有色醫(yī)院檢驗(yàn)科;3西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科;*通訊作者,E-mail:doctordian.dian@163.com)

細(xì)菌感染是威脅兒童健康的主要病因之一,而病原菌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍依賴于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)。細(xì)菌種類多、培養(yǎng)條件要求不一且耗時(shí)較長(zhǎng),此已成為限制微生物檢驗(yàn)診斷學(xué)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1,2]。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)在臨床微生物檢驗(yàn)的應(yīng)用大大縮短了鑒定時(shí)間,快速、敏感、高效的特點(diǎn)使其廣泛應(yīng)用于臨床微生物鑒定,顯著降低了樣本檢測(cè)的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本[3]。此技術(shù)不但可以直接鑒定單個(gè)純化菌落,而且直接進(jìn)行無菌體液樣本(腦脊液、血液、膽汁、胸腹水)細(xì)菌鑒定,成為近年來研究熱點(diǎn)[4-7]。由于直接鑒定的不穩(wěn)定型導(dǎo)致此項(xiàng)技術(shù)在臨床仍未大規(guī)模開展,但近年來商品化的試劑盒加速了標(biāo)本質(zhì)譜直接鑒定的發(fā)展。本研究利用Microflex LT型全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜監(jiān)測(cè)系統(tǒng)及MALDI Sepsityper試劑盒直接鑒定血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性標(biāo)本及尿常規(guī)提示細(xì)菌感染陽(yáng)性尿標(biāo)本,比較直接鑒定與傳統(tǒng)單個(gè)菌落鑒定結(jié)果符合情況,探究此快速鑒定方法的臨床價(jià)值,為患兒病原菌的及時(shí)診斷提供一個(gè)有效可行的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

1.1.1 血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警標(biāo)本 收集西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室2019年10月至2020年6月血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性標(biāo)本382份(報(bào)警時(shí)間<48 h),剔除同一人同一天報(bào)警的重復(fù)標(biāo)本。364份標(biāo)本為單一菌感染,18份標(biāo)本為兩種及兩種以上菌混合感染,其中分離出革蘭陽(yáng)性菌89株,革蘭陰性菌271株,念珠菌4株。

1.1.2 尿液標(biāo)本 收集西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室2019年10月至2020年6月尿液標(biāo)本265份。所有尿標(biāo)本要求同一天送檢尿常規(guī)結(jié)果白細(xì)胞及白細(xì)胞酯酶陽(yáng)性,提示有尿路感染的標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)譜直接鑒定。

1.2 儀器試劑

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性標(biāo)本 取1 ml陽(yáng)性血培養(yǎng)標(biāo)本置于1.5 ml EP管,根據(jù)試劑說明書,加入細(xì)胞裂解液渦旋震蕩離心,吸取上清加入清洗液中混勻,再次離心,吸上清應(yīng)用甲酸提取法得到細(xì)菌蛋白樣品,取1 μl靶板點(diǎn)樣進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.2 提示尿路感染尿液標(biāo)本 采用差速離心法富集細(xì)菌。取尿液標(biāo)本1 ml置于EP管中,2 000g離心30 s,取上清,16 000g離心5 min棄上清向沉渣中加入0.9%氯化鈉溶液500 μl震蕩混勻后12 000g離心5 min,棄上清,加1 ml去離子水洗滌沉淀,再次離心棄去上清液。取濃集的細(xì)菌標(biāo)本1 μl靶板點(diǎn)樣,溫自然干燥后加1 μl 70%甲酸破壞細(xì)胞壁,室溫干燥后再加1 μl 70%甲酸2次破壁,自然干燥后加1 μl基質(zhì)液晾干進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。收集尿路感染常見細(xì)菌配制稀釋不同濃度菌懸液,采用上述方法質(zhì)譜直接鑒定,分析其鑒定濃度檢測(cè)低限。

1.3.3 鑒定結(jié)果判斷 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀首先采集的每個(gè)樣本指紋圖譜,利用軟件BioTyper和FlexAnalysis比對(duì)分析,得到分類結(jié)果報(bào)告分值。結(jié)果得分判定標(biāo)準(zhǔn):0.000-1.699,不可靠的鑒定(紅色);1.700-1.999,可能的屬水平鑒定(黃色);2.00-2.299,確定的屬水平鑒定或可能的種水平鑒定(綠色);2.300-3.000,高置信度的種水平鑒定(綠色)。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兒童常見單一菌血流感染質(zhì)譜直接鑒定和培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果比較

單一菌血流感染,共分離出革蘭陽(yáng)性菌219株,革蘭陰性菌133株,真菌12株。MALDI-TOF-MS直接鑒定與培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果進(jìn)行比較,革蘭陽(yáng)性菌兩者鑒定符合率為84.3%(177/210),革蘭陰性菌鑒定符合率為88.4%(114/129),真菌鑒定符合率為44.4%(4/9)。MALDI-TOF-MS直接鑒定革蘭陰性菌鑒定率高于革蘭陽(yáng)性菌,分別與菌落鑒定率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。真菌直接鑒定與菌落鑒定比較,鑒定率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),具體各類菌鑒定菌株數(shù)及鑒定率見表1。

表1 質(zhì)譜血流感染直接鑒定與培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果比較 株(%)

2.2 單一菌血流感染質(zhì)譜直接鑒定和培養(yǎng)后菌落鑒定分值及曲線比較

MALDI-TOF-MS直接鑒定血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性瓶,本研究發(fā)現(xiàn)鑒定結(jié)果一致時(shí),直接鑒定分值低于菌落鑒定(見圖1),質(zhì)譜直接鑒定大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌的評(píng)分依次為1.882,1.967,1.653,而培養(yǎng)后菌落鑒定評(píng)分較高,分別為2.298,2.289,1.98。觀察細(xì)菌指紋圖譜發(fā)現(xiàn)在峰值基本一致情況下,即蛋白含量相近條件時(shí),菌落鑒定較直接鑒定細(xì)菌特征峰數(shù)量多,干擾雜峰少,匹配結(jié)果較好。

紅色為質(zhì)譜直接鑒定曲線,藍(lán)色為質(zhì)譜菌落鑒定曲線

2.3 兒童常見單一菌尿路感染質(zhì)譜直接鑒定和培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果比較

收集檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)分析菌落計(jì)數(shù)≥105cfu/ml的尿培養(yǎng)標(biāo)本264份,覆蓋兒童尿路感染常見細(xì)菌,包括革蘭陰性菌、陽(yáng)性菌及真菌。大腸埃希菌質(zhì)譜直接鑒定符合率最高(92.2%),真菌直接鑒定率較低,白色念珠菌共11株,僅3株直接鑒定到種屬,多數(shù)結(jié)果為不可靠鑒定。總體尿路感染標(biāo)本細(xì)菌直接鑒定符合率為83.3%(221/265),各種細(xì)菌直接鑒定具體結(jié)果見表2。

表2 兒童常見單一菌尿路感染質(zhì)譜直接鑒定與培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果比較 株(%)

2.4 兒童尿路感染常見菌不同檢測(cè)濃度質(zhì)譜鑒定評(píng)分情況

對(duì)兒童尿路感染常見的革蘭陰性菌及陽(yáng)性菌進(jìn)行倍比稀釋,模擬尿路感染不同細(xì)菌濃度情況,采用差速離心法離心后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌及糞腸球菌不同濃度菌液行質(zhì)譜鑒定得出鑒定結(jié)果評(píng)分見表3。尿路感染中此四種常見菌直接質(zhì)譜鑒定最低檢測(cè)限度分別為1.5×104,1.5×105,1.5×105,1.5×106,1.5×106cfu/ml。

表3 兒童常見單一菌尿路感染質(zhì)譜直接鑒定細(xì)菌濃度及對(duì)應(yīng)評(píng)分

3 討論

兒童免疫力低,細(xì)菌感染后病情發(fā)展迅速,早期且準(zhǔn)確的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果對(duì)患兒的診治尤為重要,可顯著降低用藥不當(dāng)所致的病死率和住院費(fèi)用,快速捕捉病原菌已成為國(guó)內(nèi)外微生物臨床應(yīng)用的研究熱點(diǎn)。MALDI-TOF-MS是近年發(fā)展起來的一種新型細(xì)菌鑒定技術(shù),可以快速準(zhǔn)確地進(jìn)行菌種鑒定,對(duì)培養(yǎng)后菌落的鑒定在臨床已應(yīng)用成熟。該菌落鑒定技術(shù)具有高度穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性,極大縮短了菌株的傳統(tǒng)鑒定時(shí)間,其成本也遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)生化鑒定[8,9]?，F(xiàn)階段MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)于標(biāo)本的直接鑒定仍然為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的難點(diǎn)。不同方法處理血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本后質(zhì)譜直接鑒定的研究一直不斷,但不同前處理方法可直接影響其鑒定效果及結(jié)果判定[10-12]。

本研究選取臨床常見的兩類無菌體液標(biāo)本,血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警標(biāo)本采用質(zhì)譜儀配套前處理試劑盒提蛋白后進(jìn)行直接質(zhì)譜鑒定;尿路感染患兒尿液標(biāo)本,采用差速離心法,離心取菌液沉淀直接質(zhì)譜鑒定。血培養(yǎng)標(biāo)本直接質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示,革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌、真菌的鑒定符合率分別為84.3%,88.4%,44.4%,革蘭陽(yáng)性菌及陰性菌質(zhì)譜直接鑒定與菌落鑒定結(jié)果比較無顯著差異(P>0.05),真菌直接鑒定結(jié)果不理想,與菌落質(zhì)譜鑒定結(jié)果存在較大差異,此與近年來國(guó)內(nèi)外研究一致[13]。此結(jié)果提示對(duì)于臨床血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警標(biāo)本,若涂片提示非真菌,即可直接進(jìn)行質(zhì)譜鑒定確定菌種,以具體菌名的方式向臨床發(fā)出一級(jí)預(yù)警報(bào)告,從而取代傳統(tǒng)的僅有涂片結(jié)果的一級(jí)報(bào)告模式,為臨床選擇抗菌藥物提供快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)證據(jù)。直接鑒定與菌落鑒定的細(xì)菌指紋圖譜及結(jié)果評(píng)分對(duì)比發(fā)現(xiàn),菌落鑒定圖譜的特征峰數(shù)量多,干擾雜峰少,匹配結(jié)果較好,結(jié)果分值較高,為2.00-2.299確定的屬水平鑒定或可能的種水平鑒定(綠色)。此外,該研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于報(bào)陽(yáng)時(shí)間較長(zhǎng)、生長(zhǎng)較緩慢的細(xì)菌,直接鑒定結(jié)果不理想,這與慢生長(zhǎng)菌濃度低有一定關(guān)系。尿液標(biāo)本質(zhì)譜直接鑒定過程中甲酸破壁步驟進(jìn)行了兩次,發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)兩遍甲酸處理相對(duì)一次鑒定結(jié)果更好,對(duì)于常見尿路感染菌大腸埃希菌及糞腸球菌鑒定符合率達(dá)90%以上。真菌鑒定結(jié)果符合率僅27.3%,低于同類研究結(jié)果,因?yàn)槠渌麑?shí)驗(yàn)者自建的真菌鑒定評(píng)分截點(diǎn)為1.50,低于常規(guī)鑒定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]。兒童尿路感染常見菌(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌及糞腸球菌)質(zhì)譜直接鑒定最低檢測(cè)限度分別為1.5×104,1.5×105,1.5×105,1.5×106,1.5×106cfu/ml。眾所周知,對(duì)于單純泌尿系感染的患兒,其尿液細(xì)菌濃度判斷閾值通常為105cfu/ml,結(jié)合本研究結(jié)果提示微生物檢驗(yàn)人員對(duì)于臨床明確診斷的泌尿系感染患兒尿培養(yǎng)標(biāo)本可進(jìn)行質(zhì)譜直接鑒定,縮短報(bào)告時(shí)間并指導(dǎo)臨床及時(shí)用藥,同時(shí)為探索尿培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)提供了新思路。

該研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于尿液標(biāo)本的直接鑒定,需注意以下幾點(diǎn):菌量多時(shí)峰圖信號(hào)好,檢測(cè)結(jié)果可靠,分值高;尿常規(guī)顯示蛋白尿時(shí),蛋白等雜質(zhì)干擾掩蓋檢測(cè)信號(hào),鑒定會(huì)受影響,與其他研究一致[15];兩種混合生長(zhǎng)的細(xì)菌鑒定結(jié)果不理性。有研究報(bào)道,對(duì)有兩種混合生長(zhǎng)細(xì)菌的尿液標(biāo)本MALDI-TOF-MS技術(shù)鑒定結(jié)果較差,尤其兩種菌存在優(yōu)劣勢(shì)生長(zhǎng)時(shí),往往僅能鑒定出優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的細(xì)菌[16]。此時(shí),可根據(jù)離心后涂片鏡檢結(jié)果不同微生物采用不同的預(yù)處理方法,保證結(jié)果準(zhǔn)確性。

綜上所述,本研究采用不用的前處理方法,利用MALDI-TOF-MS快速直接對(duì)血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性瓶及尿路感染尿液標(biāo)本進(jìn)行鑒定,對(duì)兒童常見感染菌結(jié)果與傳統(tǒng)菌落鑒定符合率較高。本方法實(shí)用性強(qiáng),可在急重癥感染患兒中進(jìn)行臨床推廣,以快速檢測(cè)病原菌,可作為實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充,及時(shí)為臨床選擇抗菌藥物提供病原學(xué)證據(jù)。隨著研究的不斷深入,標(biāo)本前處理方法的不斷成熟,相信MALDI-TOF-MS細(xì)菌直接鑒定及直接藥敏試驗(yàn)的應(yīng)用,會(huì)為臨床診治提供更好的實(shí)驗(yàn)室支持和幫助。