吳浩亮，浦湧，孟祥平，崔勝宇，陶波，范穌圳，徐林*

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430060；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院漢南醫(yī)院，湖北 武漢430000；3.武漢市第四醫(yī)院，湖北武漢430000）

microRNA 是一類內(nèi)源性雙鏈非編碼RNA，一般長度約為20～25 nt，在基因表達(dá)調(diào)控方面起著重要作用。自1993 年在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè) microRNA以來［1］，人們一直致力于關(guān)于microRNA 的功能研究。本文就microRNA 用于治療心血管疾病的最新靶點(diǎn)，及其在臨床治療的應(yīng)用和展望進(jìn)行了總結(jié)。

1 microRNA 在心血管疾病中的作用

1.1 microRNA 與高血壓

交感神經(jīng)系統(tǒng)激活是高血壓疾病進(jìn)展中重要的病理生理因素［2］，抑制其激活可以降低動(dòng)脈收縮壓和舒張壓，改善心肌纖維化和減少心肌細(xì)胞凋亡，能有效治療高血壓性心臟病和改善預(yù)后，延緩心力衰竭的進(jìn)展［3］。交感神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)受腎上腺素能受體α1a（adrenergic receptor α1a，ADRA1A）的調(diào)節(jié)。ADRA1A 是一種G 蛋白偶聯(lián)的跨膜受體，通過與內(nèi)源性兒茶酚胺結(jié)合增加交感神經(jīng)緊張性［4］。microRNA-19b（miR-19b）和microRNA-16（miR-16）可以靶向上調(diào)ADRA1A 基因的表達(dá)，分別向小鼠注射miR-19b 和miR-16 的拮抗劑或兩者聯(lián)合給藥均能顯著降低實(shí)驗(yàn)小鼠的動(dòng)脈收縮壓、舒張壓，減少心肌細(xì)胞纖維化和凋亡，改善高血壓進(jìn)展和預(yù)后［5］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)是引起高血壓的另一重要病理生理機(jī)制，高水平的血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）通過中樞和外周調(diào)節(jié)機(jī)制導(dǎo)致血壓增高，還可以使促炎細(xì)胞因子和活性氧的表達(dá)增加，誘導(dǎo)血管炎癥和內(nèi)皮功能障礙［6］。在一項(xiàng)動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，microRNA-29b 可觸發(fā)AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓和血管內(nèi)皮損傷，其過程部分由CTRP6/ERK/PPARγ 軸介導(dǎo)，而下調(diào)miR-29b 可以減少AngⅡ的分泌，從而改善AngⅡ介導(dǎo)的高血壓和血管內(nèi)皮損傷［7］。

1.2 microRNA 與冠心病

1.2.1microRNA 與缺血再灌注損傷 心肌缺血再灌注損傷（I/R）是目前急性心肌梗死后再灌注治療常見并發(fā)癥［8］，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。不同類型microRNA 對(duì)I/R 后損傷心肌起到了不同的保護(hù)作用，亦是治療的新靶點(diǎn)。microRNA-15b（miR-15b）增加了缺氧條件下的心肌細(xì)胞耐受能力，動(dòng)物試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，再灌注期間使用外源性microRNA-15b 治療，梗死面積較對(duì)照組顯著減?。?］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-327（miR-327）表達(dá)水平在心肌I/R后明顯升高，利用腺病毒轉(zhuǎn)染反義核苷酸沉默miR-327 可明顯增加caspase-9、Cyt-c 和Bax 等抗凋亡分子表達(dá)水平，同時(shí)降低Bcl-2 等促凋亡分子的表達(dá)。因此抑制心梗后miR-327 過表達(dá)可以保護(hù)心肌細(xì)胞，減少再灌注后心肌梗死面積［10］。

在心肌I/R 損傷中，PIK3R3/AKT3 是具有保護(hù)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，microRNA-181b-5p（miR-181b-5p）通過直接與其3′-非翻譯區(qū)結(jié)合而負(fù)性調(diào)控AKT3 和PIK3R3 的表達(dá)，而抑制miR-181b-5p 則可上調(diào)AKT3 和PI3KR3，起到保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注損傷的作用［11］。

在大鼠急性I/R 模型中，循環(huán)microRNA-145（miR-145）的水平降低。通過腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-145 表達(dá)水平，可顯著降低缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌電生理不穩(wěn)定性以及心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，其機(jī)制是通過抑制CaMKII 介導(dǎo)的ASK1 抗凋亡途徑和NF-κB p65 抗炎途徑［12］。

1.2.2microRNA 與心肌梗死 隨著冠脈介入手術(shù)的發(fā)展，急性心肌梗死的死亡率顯著下降［13］，保護(hù)梗死后心肌，延緩和改善心梗后心力衰竭，增加患者遠(yuǎn)期生存率成為心肌梗死的治療目標(biāo)。有研究證實(shí)，microRNA-19a/19b 對(duì)成人心臟的保護(hù)分為兩個(gè)階段：心肌梗死后早期和長期保護(hù)。利用腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染microRNA-19a/19b 可以減輕心肌梗死引起的心臟損傷，保護(hù)心臟功能，并刺激心肌細(xì)胞再生［14］。microRNA-34a（miR-34a）是心肌梗死后心臟修復(fù)和再生的重要內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，miR-34a 的過度表達(dá)直接加速了再生心肌細(xì)胞的死亡，而抑制miR-34a 可以促進(jìn)心肌細(xì)胞周期活性和心肌細(xì)胞的修復(fù)，減輕心肌梗死后心肌重塑和纖維化［15］。

心肌梗死后患者常常發(fā)生惡性心律失常而死亡，因此增強(qiáng)梗死后心肌電生理穩(wěn)定性是治療的一大重點(diǎn)。Liu 等［16］的研究證實(shí)，通過上調(diào)microRNA-145 水平可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞的電生理穩(wěn)定性，改善心梗引起的心肌纖維化及心肌重塑，降低了心肌細(xì)胞對(duì)β 腎上腺素能受體（β-AR）刺激的反應(yīng)，從而很大程度上減少了心肌梗死后惡性心律失常的發(fā)生。

1.3 microRNA 與心肌肥厚

心肌病理性肥厚與Ca2+持續(xù)內(nèi)流有關(guān)。內(nèi)流鈣離子激活CaN-NFAT 通路誘導(dǎo)心肌肥厚［17］。誘導(dǎo)心肌肥厚的Ca2+主要通過L 型Ca2+通道（LTCCs）流入［18］。Chu 等［19］通過熒光素酶報(bào)告分析發(fā)現(xiàn)，microRNA-135b（miR-135b）靶向抑制L-型電壓依賴鈣離子通道α1C 亞基（CACNa1C）的表達(dá)。在主動(dòng)脈縮窄小鼠模型中過表達(dá)miR-135b，可以減少Ca2+持續(xù)內(nèi)流，明顯減輕病理性心肌肥厚。Ang II 的慢性升高也是誘發(fā)心肌肥厚一個(gè)主要因素，但其作用的具體分子機(jī)制尚不清楚［20］。Yu 等［21］發(fā)現(xiàn)心臟和神經(jīng)嵴表達(dá)的衍生物2（heart and neural crest derivatives-expressed 2，HAND2）參與Ang-II 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程，microRNA-92b-3p 可以減少HAND2 的表達(dá)，從而抑制Ang-II 誘導(dǎo)的心肌肥大。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肥厚刺激心肌細(xì)胞microRNA-212（miR-212）和microRNA-132（miR-132）的表達(dá)上調(diào)，抑制miR-212 和miR-132 的表達(dá)對(duì)小鼠壓力超載誘導(dǎo)的心肌肥厚有保護(hù)作用［22］，經(jīng)進(jìn)一步臨床前研究發(fā)現(xiàn)，一種特定的miR-132 抑制劑可以逆轉(zhuǎn)壓力負(fù)荷超載誘導(dǎo)小鼠和豬的心肌肥厚［23］。

1.4 microRNA 與心律失常

microRNA 參與調(diào)節(jié)心臟興奮的產(chǎn)生及傳導(dǎo)等許多方面，包括除極、復(fù)極、自動(dòng)除極、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)等過程［24］。房室結(jié)細(xì)胞是慢反應(yīng)細(xì)胞，其細(xì)胞表面離子通道的狀態(tài)會(huì)影響房室結(jié)信號(hào)的傳導(dǎo)。microRNA-1（miR-1）的過表達(dá)降低了心肌細(xì)胞表面IK1和ICa，L離子通道密度，減慢了房室結(jié)的傳導(dǎo)，增加小鼠對(duì)房室傳導(dǎo)阻滯（AVB）的易感性。而使用miR-1 拮抗劑則逆轉(zhuǎn)了這種變化，為臨床治療AVB提供了一種新思路［25］。房顫的發(fā)生同樣也與L 型鈣離子通道異常有關(guān)。L 型鈣電流減弱會(huì)加速復(fù)極化，縮短心房動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間（APD），增加房顫的發(fā)生率［26］。在治療房顫的研究中，Lu 等［27］通過腺病毒轉(zhuǎn)染在犬心房和小鼠體內(nèi)過表達(dá)microRNA-328（miR-328），發(fā)現(xiàn)LCa，L電流減弱，心房APD 縮短，房顫易感性增強(qiáng)。而敲除miR-328 基因或注射miR-328 反義核苷酸沉默其表達(dá)，房顫易感性明顯減弱。miR-328 這種促進(jìn)房顫的作用是通過下調(diào)L型鈣離子通道蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，這使miR-328 有望成為未來房顫治療的新靶點(diǎn)。

1.5 microRNA 與心力衰竭

心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床綜合征，是大多數(shù)心血管疾病發(fā)展的終末狀態(tài)。目前臨床治療心力衰竭的目標(biāo)是改善患者生存質(zhì)量，延緩心力衰竭的發(fā)展［28］。在心肌梗死誘發(fā)的心力衰竭中，早期間質(zhì)纖維化是有利的，但長期過度的纖維化會(huì)造成心室壁僵硬，舒張和收縮功能障礙，最終發(fā)展為心力衰竭［29］。microRNA-1 能夠逆轉(zhuǎn)心力衰竭早期的心肌重塑已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)［30］。在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠模型中，microRNA-221/222可以抑制TGF-β/SMAD 信號(hào)通路誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和分化［31］，從而可以抑制心力衰竭的發(fā)展。

線粒體氧化代謝為心肌細(xì)胞提供能量，其功能障礙是心力衰竭發(fā)生的重要病理機(jī)制［32］。LaRocca與其團(tuán)隊(duì)［33］研究發(fā)現(xiàn)microRNA-152（miR-152）可以直接靶向抑制維持線粒體鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白谷胱甘肽5（Glrx5），使心肌細(xì)胞線粒體鐵超載，能量供應(yīng)受損，誘發(fā)心力衰竭。而利用反義核苷酸沉默miR-152 的表達(dá)可以延緩心衰的進(jìn)展。

1.6 microRNA 與先天性心臟病

先天性心臟病是指心臟和血管在胚胎發(fā)育階段出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，引起血流動(dòng)力學(xué)異常的一種病變。心臟發(fā)育是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，涉及到細(xì)胞分化和形態(tài)構(gòu)建過程中基因表達(dá)的精確協(xié)調(diào)，越來越多的研究表明microRNA 在調(diào)控心臟發(fā)生和發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［34］。研究者通過構(gòu)建先天性心臟病胎鼠模型，發(fā)現(xiàn)在先天性心臟病胎鼠的心內(nèi)膜細(xì)胞中，microRNA-34a（miR-34a）表達(dá)上調(diào)，而抑制miR-34a 的表達(dá)則心內(nèi)膜細(xì)胞生長抑制作用消失［33］。另一項(xiàng)類似的實(shí)驗(yàn)表明microRNA-592（miR-592）在小鼠的心臟發(fā)育中抑制心肌細(xì)胞增殖及 心臟發(fā)育，促進(jìn)心臟畸形產(chǎn)生［34］。這 些microRNA 在心臟發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)量的異常升高和降低都會(huì)影響心臟的發(fā)生和發(fā)育，從而導(dǎo)致先天性心臟病。調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵microRNA 的表達(dá)將會(huì)是未來預(yù)防先天性心臟病的潛在措施。

1.7 microRNA 與其他心臟疾病

microRNA 還參與其他心臟疾病的病理過程的調(diào)控。大部分心臟瓣膜病是由于自身免疫機(jī)制失調(diào)，異常的免疫攻擊導(dǎo)致瓣膜功能失調(diào)。其中，microRNA-155（miR-155）通過靶向miR-155-S1PR1和miR-155-SOCS1-STAT3 信號(hào)通路介導(dǎo)鏈球菌誘導(dǎo)的瓣膜損傷，而通過轉(zhuǎn)染腺病毒抑制miR-155 的水平可以減輕心臟瓣膜損傷的進(jìn)展［35］。研究發(fā)現(xiàn)，另一類老年退化性瓣膜病—?jiǎng)用}瓣鈣化也與microRNA 異常調(diào)控相關(guān)，其中microRNA-34A（miR-34A）可以通過抑制Notch1 表達(dá)增加主動(dòng)脈瓣鈣沉積，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)microRNA-34A 明顯改善主動(dòng)脈鈣化的程度［36］。另外一些報(bào)道表明microRNA-214、microRNA-20、microRNA-29b 等也參與動(dòng)脈瓣鈣化機(jī)制的調(diào)節(jié)［37-38］。心肌病是心臟疾病的另一大重要分支，通常以遺傳性因素引起心肌本身病變，表現(xiàn)為心室的肥厚或擴(kuò)張。Zhou 等［39］通過對(duì)擴(kuò)張性心肌病小鼠心臟組織microRNA 微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠比較，擴(kuò)張性心肌病的小鼠心臟組織中microRNA-208b（miR-208b）水平顯著上調(diào)，隨后的研究中通過增加和抑制miR-208b 的表達(dá)證明miR-208b 參與擴(kuò)張性心肌病的病理過程。由于肥厚性心肌病病因較為復(fù)雜，多數(shù)模擬肥厚性心肌病的模型仍為壓力超負(fù)荷模型，能反映在肥厚性心肌病機(jī)制中的microRNA 調(diào)控作用有限。其他與microRNA 調(diào)控相關(guān)的心臟疾病的研究多與生物標(biāo)記物相關(guān)，治療相關(guān)臨床前研究鮮有，便不再贅述。

2 microRNA 在臨床治療中的應(yīng)用

2.1 基于microRNA 治療的臨床設(shè)計(jì)

針對(duì)基因的治療，可以基于DNA 及mRNA。兩者相比較，基于mRNA 療法有諸多優(yōu)勢(shì)，例如作用范圍廣、安全性高、成本低且更為高效［40］，其中利用microRNA 調(diào)節(jié)mRNA 的基因治療方案逐漸趨于成熟。臨床上開發(fā)一種microRNA 藥物都會(huì)經(jīng)歷以下步驟：首先研究感興趣的疾病模型與正常機(jī)體組織之間microRNA 的表達(dá)差異，其次對(duì)所篩選的microRNA 進(jìn)行功能及機(jī)制研究。再次，結(jié)合患者體內(nèi)microRNA 水平設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療方案。如果需要對(duì)microRNA 進(jìn)行功能增益，可以通過引入合成microRNA 來完成；相反，如果需要相應(yīng)的microRNA功能喪失，可以利用反義寡核苷酸沉默其表達(dá)。對(duì)microRNA 治療方案的靶向性、安全性、藥效動(dòng)力學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究后，對(duì)microRNA 分子進(jìn)行優(yōu)化，增加治療作用，降低毒性后即進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)［41］。

2.2 microRNA 在心臟疾病中的臨床應(yīng)用

在其他疾病治療領(lǐng)域，基于microRNA 的療法已應(yīng)用于臨床，例如microRNA-122 的反義抑制劑治療丙型肝炎［33］，microRNA-34 治療肝細(xì)胞癌［42，43］，microRNA-506 治療鼻咽癌［44］等。目前，microRNA在心臟疾病中的應(yīng)用大部分聚焦于作為疾病發(fā)生及進(jìn)展中的生物標(biāo)記物。隨著研究的深入，首例microRNA-132（miR-132）抑制劑治療心力衰竭已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。在這項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照雙盲臨床試驗(yàn)中［45］，與安慰劑組對(duì)比，新型的miR-132 抑制劑CDR132L 顯著減少了患者體內(nèi)miR-132 水平，患者心功能明顯改善，射血分?jǐn)?shù)升高，NT-proBNP 水平下降，并且沒有明顯的毒副作用。這項(xiàng)臨床試驗(yàn)的成功標(biāo)志著microRNA 治療心臟疾病正式進(jìn)入臨床，為未來其他microRNA 進(jìn)入臨床治療心臟疾病開辟了先例。但值得關(guān)注的是，此例臨床試驗(yàn)應(yīng)用的是microRNA 抑制劑。由于microRNA 自身不穩(wěn)定、易降解，針對(duì)microRNA 替代治療方案，例如運(yùn)輸microRNA 的載體，仍然存在一定問題。

2.3 載體技術(shù)的發(fā)展

早期，一些未經(jīng)修飾或者簡(jiǎn)單修飾的microRNA，在沒有結(jié)合載體的條件下應(yīng)用于臨床，劑量過大和臨床療效有限使人們對(duì)于microRNA 的治療效果產(chǎn)生質(zhì)疑［46］。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)microRNA 分子本身是親水性的，而細(xì)胞膜對(duì)親水性物質(zhì)通透性很低，裸microRNA 很難被細(xì)胞攝?。?7］，肝腎的代謝作用也會(huì)快速消除體內(nèi)外源性microRNA［48］。因此科學(xué)家開始對(duì)運(yùn)載microRNA 的載體進(jìn)行探索。目前常用的載體（圖1 所示）介紹如下。

圖1 常見的幾種microRNA 載體

2.3.1病毒載體 腺相關(guān)病毒（AAV）在肝臟、肌肉和神經(jīng)等組織中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)越，使它成為基因治療較為理想的載體［49］，已批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，越來越多的臨床試驗(yàn)證明了其療效［50］。但有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用AAV 作為microRNA 治療載體不可避免地存在細(xì)胞毒性［49］。在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究者通過腺相關(guān)病毒載體傳遞來源于人的miR-132-199a 以刺激豬心肌梗死后心臟的修復(fù)。一個(gè)月后實(shí)驗(yàn)組心臟功能改善明顯，瘢痕大小也顯著縮小，但隨后持續(xù)出現(xiàn)無法控制的microRNA 表達(dá)使實(shí)驗(yàn)豬突發(fā)心律失常而死亡，這使科學(xué)家們認(rèn)識(shí)到腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的microRNA 基因轉(zhuǎn)錄存在過表達(dá)危害［51］。同樣，向正常新生小鼠和患有粘多糖貯積癥新生小鼠注射表達(dá)β-葡萄糖苷酶的AAV 載體會(huì)增加小鼠罹患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)，證明AAV 作為基因載體具有明顯的基因毒性［52］。雖然小鼠與人類基因不具有同源性，但是可以為AAV 作為基因載體治療人類疾病提供一定的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警，并促使研究者們開始逐漸將目光聚焦于非病毒基因載體。

2.3.2外泌體載體 相較于病毒載體，外泌體運(yùn)載microRNA 具有顯著優(yōu)勢(shì)。它是細(xì)胞間天然的RNA運(yùn)載系統(tǒng)，可以保護(hù)運(yùn)載的microRNA 免受循環(huán)內(nèi)RNA 酶的消化，且易于被細(xì)胞所攝?。?3］。但外泌體作為microRNA 運(yùn)載體在實(shí)際操作過程中也存在一些技術(shù)難題，如靶向性不高，不能與特定的靶向病變組織或細(xì)胞結(jié)合，從而導(dǎo)致治療效果不佳和脫靶效應(yīng)［54］。而利用超聲輔助將很大程度上增強(qiáng)靶向性，減少靶外效應(yīng)［55］。其次，外泌體存在產(chǎn)量低，難以大量獲取的問題，限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，研究人員開發(fā)了紅細(xì)胞外泌體用于運(yùn)載microRNA，可以相對(duì)克服這種劣勢(shì)［56］。關(guān)于外泌體遞送系統(tǒng)的研究仍在不斷優(yōu)化中。

2.3.3無機(jī)納米材料載體 一大批納米無機(jī)高分子材料開始被嘗試作為運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)microRNA，例如納米水凝膠載體［57］、生物活性玻璃納米顆粒載體［58］、磷酸鈣納米載體［59］和氧化石墨烯載體［60］等。然而，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)無機(jī)納米材料具有細(xì)胞毒性，顯著降低了細(xì)胞活性。microRNA 與非病毒載體相互作用比較強(qiáng)，難以釋放［61］。多數(shù)無機(jī)材料難以在體內(nèi)降解，會(huì)產(chǎn)生蓄積效應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性，因此納米無機(jī)高分子材料作為microRNA 運(yùn)載體也存在著諸多的技術(shù)難題，目前臨床上尚無切實(shí)可行的靶向核酸運(yùn)載載體用于治療心血管疾?。?2］。

綜上所述，microRNA 參與多種心臟病理生理狀態(tài)的調(diào)節(jié)，在未來心血管疾病治療中應(yīng)用前景廣闊。最新的microRNA 抑制劑治療心力衰竭在臨床上取得成功標(biāo)志著microRNA 治療心血管疾病大時(shí)代的到來。但microRNA 自身應(yīng)用于臨床治療仍存在諸多挑戰(zhàn)，例如microRNA 的穩(wěn)定性、安全性、載體靶向性和生物相容性等。但我們相信通過對(duì)microRNA 作用機(jī)制的不斷探索以及對(duì)載體的持續(xù)改進(jìn)，microRNA 終將會(huì)成為未來臨床治療心血管疾病的一把利劍，為心血管疾病患者帶來福音。