鄭蒲玨，黃文燕，曾素娟，楊雪超

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科，廣東 廣州510182；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，廣東省口腔組織修復(fù)與重建工程技術(shù)研究中心，廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，廣東 廣州510182）

摻鉺釔鋁石榴石（Er：YAG，簡稱“鉺”）激光波長為2 940 nm，在水及羥基磷灰石OH-的吸收峰附近［1-2］。Er：YAG 激光消融硬組織是建立在光熱機械作用的基礎(chǔ)上，因此在使用Er：YAG 激光時，不應(yīng)忽視牙體硬組織熱損傷的風(fēng)險。熱分析研究結(jié)果顯示，有機成分、水分子和碳酸鹽在100 ℃以上即可發(fā)生熱改性［3］。無機和有機成分的變化可影響牙體硬組織的硬度、滲透性、溶解性或粘附性［4］。粘接是保持修復(fù)體遠(yuǎn)期成功的重要因素。樹脂基修復(fù)材料與牙本質(zhì)的粘接原理為粘接劑滲透至膠原纖維網(wǎng)形成混合層和滲透至牙本質(zhì)小管內(nèi)形成樹脂突。

牙本質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和化學(xué)組分是牙本質(zhì)修復(fù)治療的重要影響因素。與以往大部分研究激光處理后牙本質(zhì)表面變化的報道不同，本研究將探索Er：YAG 處理后涂布自酸蝕粘接系統(tǒng)及全酸蝕粘接系統(tǒng)后牙本質(zhì)的表面形貌，同時研究激光處理對牙本質(zhì)表面下層化學(xué)組分及顯微硬度的影響。臨床上最重要的激光參數(shù)之一是脈沖持續(xù)時間（即脈寬），其與激光的切削能力和牙體組織的熱沉積密切相關(guān)［5］。激光脈沖越快，切削能力越強，熱量傳導(dǎo)到鄰近組織的時間越短，組織殘留熱量越低，熱損傷越低。到目前為止，臨床激光裝置可設(shè)置的最短脈寬為50 μs。本研究擬采用短脈沖模式（50 μs 脈寬）及300 μs 脈寬鉺激光處理牙本質(zhì)，得出更有利于粘接的激光參數(shù)結(jié)合掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）、能量色散X 射線光譜（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX）、顯微硬度儀定性及定量評估牙本質(zhì)表面及下層性狀的變化。

1 材料與方法

1.1 處理樣本

本項目已通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會審查（倫理審批編號：KY2019002）。本實驗樣品為因阻生拔除的完整人類第三磨牙，離體牙納入的標(biāo)準(zhǔn)為無齲壞、無氟斑、無釉質(zhì)發(fā)育不全和非四環(huán)素牙。拔牙后用手工潔治器刮除牙體上的軟組織、色素，置于1%氯胺T 溶液中4 ℃保存。使用高速渦輪機金剛砂車針在水噴霧下去除冠部釉質(zhì)層，暴露中層牙本質(zhì)，作為牙本質(zhì)圓盤表面。將每顆牙從釉牙骨質(zhì)界下2 mm 處切斷牙根，去除牙髓，大致按照半徑約5 mm、厚度3 mm 的規(guī)格初步制備牙本質(zhì)圓盤。#320、800、1 200、3 000 目砂紙在流水下于磨片機（EXAKT，E400CS，北京共贏聯(lián)盟國際科技有限公司，德國）上拋光1 min，在30 倍體視顯微鏡（Leica，EZ4 W，徠卡，德國）下觀察確保無釉質(zhì)殘留，棄去表層有裂紋的牙塊，超聲波振蕩清洗20 min，得到最終牙本質(zhì)圓盤，置于0.9%生理鹽水中4 ℃保存，1 周內(nèi)用于實驗。

1.2 牙本質(zhì)表面切削

球鉆組：采用金剛砂球鉆處理，高速渦輪機上金剛砂球鉆在水冷卻下去除一薄層牙本質(zhì)，每5 次預(yù)備后更換新的球鉆。

Er：YAG 激光處理組：實驗光源為Er：YAG 激光（Fotona 歐洲之星，M021-5AF/1，F(xiàn)otona d.d.，斯洛文尼亞），脈沖頻率0～50 Hz 可調(diào)，激光光束通過關(guān)節(jié)臂傳輸后經(jīng)透鏡直接聚焦于組織樣品上，光斑直徑為1.3 mm。激光消融參數(shù)：能量100 mJ，頻率20 Hz，脈沖寬度分別為50 μs 或300 μs。在連續(xù)噴水噴霧下，在距靶點1 mm 的非直接接觸模式下，用R14 型手持設(shè)備進行激光傳輸，移動激光手具，使其通過牙塊的全長度形成一個線狀的隧道樣照射區(qū)［6］。

1.3 粘接處理

本研究使用金剛砂球鉆、參數(shù)為100 mJ 及50 μs的Er：YAG 激光、參數(shù)為100 mJ 及300 μs Er：YAG 激光切削牙本質(zhì)表面，每組6 個樣本，分別進行以下處理：（1）按說明書涂布自酸蝕粘接劑；（2）不進行酸蝕處理，僅涂布全酸蝕粘接劑；（3）37%磷酸蝕刻15 s 后，涂布全酸蝕粘接劑；（4）37%磷酸蝕刻30 s 后，涂布全酸蝕粘接劑。本研究使用的自酸蝕粘接劑為一步法弱酸型粘接系統(tǒng)（iBond，賀利氏，德國），涂布牙面后靜置10 s，用強壓空氣除去揮發(fā)成分后使用光固化燈（3M ESPE，Elipar TM S10，3M Deutschland Gmbh，美國）照射10 s；全酸蝕粘接劑為以丙酮為溶劑的Prime Bond NT（Dentsply，德國），用37%磷酸酸蝕15 s，水氣加壓沖洗15 s，再涂布粘接劑，保持濕潤20 s，氣槍吹5 s，光固燈照射10 s。涂布粘接劑并光固化后進行掃描電子顯微鏡檢測。

1.4 顯微硬度檢測

采用投硬幣法在經(jīng)金剛砂球鉆或參數(shù)為100 mJ 及50 μs 的Er：YAG 激光中各隨機抽取5 個樣本，表面處理后的樣品中心沿頰舌方向縱切分成兩部分，一部分進行顯微硬度檢測，另一部分進行掃描電子顯微鏡-能譜儀檢測。將縱切后的牙塊側(cè)面依次在#320、800、1 200、3 000 目砂紙流水下拋光，形成光滑的表面，超聲波振蕩清洗20 min，環(huán)氧樹脂將牙塊固定在圓柱形板中。采用平行度計，確保表面與水平面保持平行，在距離表面30 μm 深度的管間牙本質(zhì)加壓，壓痕的加載力為1 gf，重復(fù)測量6 次，記錄顯微硬度值。

1.5 掃描電鏡及X 射線能量色散譜檢測

EDX 借助于分析樣品發(fā)出的元素特征X 射線的波長和強度實現(xiàn)的，根據(jù)波長測定元素組成，根據(jù)強度測定元素的相對含量［7］。樣品經(jīng)常規(guī)固定、干燥、噴金，用SEM（日立，S-3400N II，Hitachii，日本）分析牙本質(zhì)組織微結(jié)構(gòu)變化，放大倍數(shù)為1 000、3 000，加速電壓為15 kV。用安裝在SEM 上的EDX（550i，IXRF Sytems，Austin TX，美國）檢測消融牙本質(zhì)元素的組成，每個樣本隨機選取3～4 個激光照射區(qū)域和正常骨組織區(qū)域，測定鈣（Ca）、磷（P）元素的含量（Atomic %），并計算鈣/磷比例。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，采用Wilcoxon 秩和檢驗、t檢驗和Kruskal Wallis H 檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙本質(zhì)表面形貌分析

SEM 結(jié)果如圖1 顯示，球鉆組牙本質(zhì)表面有一玷污層，牙本質(zhì)小管封閉；Er：YAG 激光組牙本質(zhì)表面呈鱗片狀不規(guī)則形態(tài)，無玷污層，牙本質(zhì)小管開放，呈袖口狀突出。涂布自酸蝕粘接劑后，球鉆組表面見少量不規(guī)則、粗糙的多層突起物，100 mJ 及50 μs的Er：YAG 激光組表面可見大量不規(guī)則、粗糙的多層突起物，100 mJ 及300 μs 的Er：YAG 激光組表面覆蓋一層粗糙的粘接層，可見大量散在孔隙，未見多層突起物。未酸蝕而直接涂布全酸蝕粘接劑后，3 組牙本質(zhì)表面均覆蓋一層均勻的粘接層，其中球鉆組表面見少量粗糙的突起物。磷酸蝕刻15 s及涂布全酸蝕粘接劑后，球鉆組牙本質(zhì)表面覆蓋一層薄而均勻的粘接層，有少量散在孔隙，100 mJ 及50 μs 的Er：YAG 激光組表面可見粗糙的粘接層，可見較多散在孔隙，100 mJ 及300 μs 的Er：YAG 激光組表面可見均勻的粘接層，可見大量散在孔隙。磷酸蝕刻30 s 及涂布全酸蝕粘接劑后，球鉆組牙本質(zhì)表面覆蓋一層薄而均勻的粘接層，有大量散在孔隙，100 mJ 及50 μs 的Er：YAG 激光組表面可見粗糙的粘接層，可見少量散在孔隙，100 mJ 及300 μs 的Er：YAG 激光組表面可見均勻的粘接層，可見較多散在孔隙。

圖1 掃描電鏡下牙本質(zhì)表面形貌圖（2 000×，標(biāo)尺20 μm）

球鉆組及Er：YAG 激光組分別進行自酸蝕粘接、全酸蝕粘接、酸蝕15 s+粘接、酸蝕30 s+粘接處理后，球鉆組表面玷污層，涂布粘接后牙本質(zhì)表面形貌分別為少量不規(guī)則多層突起物、少量粗糙突起物、薄而均粘接層、薄而均粘接層有大量孔隙；激光組表面呈鱗片狀，涂布粘接后牙本質(zhì)形貌顯示，100 mJ及50 μs 組有大量不規(guī)則多層突起物、均勻粘接層、粗糙粘接層及較多孔隙、粗糙粘接層及少量孔隙；100 mJ 及300 μs 組有大量孔隙的粗糙粘接層、均勻粘接層、大量孔隙的均勻粘接層、較多散在孔隙的均勻粘接層。

2.2 牙本質(zhì)表面鈣磷比例分析

EDX 結(jié)果如圖2 顯示，球鉆組牙本質(zhì)表面鈣磷比例為0.86±0.06，Er：YAG 激光組牙本質(zhì)表面鈣磷比例為0.85 ±0.02，兩組間鈣磷比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.416，P=0.685）。

圖2 兩組牙本質(zhì)表面鈣磷比例

2.3 牙本質(zhì)下層不同深度鈣磷比例分析

EDX 結(jié)果如圖3 顯示，Er：YAG 激光及球鉆處理后，牙本質(zhì)下層5～30 μm 處鈣磷比例與表層間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P球鉆=0.15；在激光組，與表層組相比，P5μm=0.1，P10μm=0.7，P15μm=0.4，P20μm=1.0，P25μmμm=0.1，P30μm=0.1）。Er：YAG 激光組與球鉆組在牙本質(zhì)表面及下層不同深度處的鈣磷比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P表層=1.0P5μm=0.7，P10μm=1.0，P15μm=0.7，P20μm=0.7，P25μm=0.4，P30μm=0.4＞0.05）。

2.4 顯微硬度分析

顯微硬度測量結(jié)果如圖4 顯示，Er：YAG 激光處理后牙本質(zhì)下層30 μm 處顯微硬度值為71.9 ±4.44，球鉆處理后牙本質(zhì)下層30 μm 處顯微硬度值為66.84 ± 3.73，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.337，P=0.000）。

3 討論

臨床上常使用全酸蝕技術(shù)處理牙本質(zhì)表面，由于牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)間含水量的差異，酸蝕優(yōu)先去除管周牙本質(zhì)，形成擴大的漏斗狀開口的小管；酸蝕還可暴露多微孔、脫礦的膠原纖維網(wǎng)，便于樹脂基粘接劑滲透形成混合層。本研究結(jié)果顯示，Er：YAG 激光處理后，牙本質(zhì)表面呈鱗片狀不規(guī)則形態(tài)，無玷污層，牙本質(zhì)小管開放，呈袖口狀突出。利用渦輪手機磨削牙齒后，會在牙體表面留下一玷污層，使牙本質(zhì)小管封閉。這說明鉺激光對牙本質(zhì)的作用不同于酸蝕，激光更多地選擇性消融管間牙本質(zhì)，形成袖口狀突出的小管，且激光處理沒有暴露形成混合層所必需的膠原纖維網(wǎng)，這與以前的研究結(jié)果是一致的［8-9］。

牙本質(zhì)由有機組分和無機組分組成，其中無機組分主要是羥基磷灰石晶體中的鈣和磷。當(dāng)有機組分與無機組分發(fā)生變化時，鈣磷比值發(fā)生變化，可能影響硬組織的滲透性、溶解性和粘附性［4］。激光照射后生物組織的化學(xué)改變很大程度上取決于其成分的性質(zhì)。與以往大部分研究不同，本研究對牙本質(zhì)不同深度處的鈣磷比例進行檢測，結(jié)果表明，參數(shù)為100 mJ 及50 μs 的Er：YAG 激光組與球鉆組間牙本質(zhì)下層0～30 μm 范圍內(nèi)鈣磷比例無顯著性差異。Katirci 等［10］研究表明，激光處理后牙本質(zhì)表面鈣磷比例與球鉆組間無顯著性差異（P＞0.05）。不同深度的牙本質(zhì)鈣磷含量、小管密度不同，推測表面與深層間鈣磷比例的差異可能與牙本質(zhì)的部位及深度有關(guān)，與激光照射無顯著相關(guān)性。

顯微硬度檢測結(jié)果顯示參數(shù)為100 mJ 及50 μs的激光組的顯微硬度高于球鉆組（P＜0.05），這與Moosavi 等［11］研究結(jié)果一致，該團隊研究發(fā)現(xiàn)相對于傳統(tǒng)高速手機，Er：YAG 激光處理提高牙本質(zhì)下層基質(zhì)30 μm 處的顯微硬度及鈣含量，推測可能是因為水和有機組分蒸發(fā)使基質(zhì)中礦物質(zhì)含量相對增加，從而提高牙本質(zhì)硬度。而He 等［6］發(fā)現(xiàn)激光處理后牙本質(zhì)顯微硬度、彈性模量在10 μm 以內(nèi)下降約40%，15～50 μm 范圍內(nèi)與正常牙本質(zhì)無明顯區(qū)別。在不同的照射條件下，Er：YAG 激光可引起不同的組織改性結(jié)果。Chinelatti 等［12］使用不同能量水平（160、200、260、300、360 mJ）的Er：YAG 激光分別處理淺層、深層牙本質(zhì)，最低能量水平（160 mJ）增加淺層牙本質(zhì)表面（20 μm 范圍內(nèi)）的顯微硬度，160、200 mJ 的能量未影響深層牙本質(zhì)表面（20 μm范圍內(nèi)）的顯微硬度，而更高的能量水平均使淺層及深層牙本質(zhì)的顯微硬度降低，160 mJ 能量組的牙本質(zhì)硬度最高，360 mJ 能量組硬度最低。高能量Er：YAG 激光所引起的硬度改變可能與牙本質(zhì)有機基質(zhì)的變性后其抵抗局部變形能力降低有關(guān)。

Er：YAG 激光消融硬組織是建立在光熱機械作用的基礎(chǔ)上的，照射過程中產(chǎn)生的過量熱量可引起牙齒硬組織的超微結(jié)構(gòu)和成分的變化。Er：YAG 激光的能量主要被水吸收，水介導(dǎo)的爆炸式組織去除法已被證明是最有效去除硬組織的方法，水爆破的同時可轉(zhuǎn)移熱量，使傳遞到鄰近牙體組織的熱量降低。熱效應(yīng)的強度取決于激光參數(shù)，包括能量、頻率、波長、脈寬等及組織的光學(xué)特性。本研究實驗得到的更有利于粘接的激光參數(shù)為50 μs 脈寬，很多研究認(rèn)為50 μs 脈寬是臨床上適合有效的牙體硬組織消融參數(shù)，伴隨外部水噴霧時，可有效地消融牙體硬組織，減少熱損傷。Trevelin 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，50 μs 脈沖寬度的Er：YAG 激光預(yù)處理牙本質(zhì)是保持膠原纖維結(jié)構(gòu)完整的最佳方案，300、600 μs 組則可見牙本質(zhì)表面熔融、碳化，膠原纖維融合區(qū)消失，纖維間隙消失。Cersosimo 等［14］使用50 μs 脈寬Er：YAG 激光分別處理正常、脫礦牙本質(zhì)，相對于未使用激光的球鉆組，微剪切強度提高，認(rèn)為使用短脈沖激光有利于改善牙本質(zhì)的粘接性能。在臨床中，必須優(yōu)化激光參數(shù)來減少熱效應(yīng)，以避免對后續(xù)粘接產(chǎn)生負(fù)面影響。本研究在鉺激光處理牙本質(zhì)后，進行常規(guī)粘接處理，掃描電鏡顯示，不論是自酸蝕粘接處理或是全酸蝕粘接處理，100 mJ 及300 μs 的Er：YAG 激光組的牙本質(zhì)表面均較100 mJ 及50 μs 的Er：YAG 激光組有很多的散在孔隙，這可能會影響混合層的粘接強度。由此推測，100 mJ 及50 μs 激光處理后的牙本質(zhì)較100 mJ 及300 μs 激光處理組更利于粘接層形成。

本研究不僅探索Er：YAG 激光處理對牙本質(zhì)表面下層化學(xué)組分及顯微硬度的影響，同時研究涂布自酸蝕粘接系統(tǒng)及全酸蝕粘接系統(tǒng)后激光處理牙本質(zhì)的表面形貌，更直觀地探討Er：YAG 激光蝕刻及球鉆處理后哪種粘接系統(tǒng)效果更優(yōu)。對使用不同粘接系統(tǒng)后形成的粘接界面進行電鏡掃描的結(jié)果顯示，涂布自酸蝕粘接系統(tǒng)后50 μs 激光組的牙本質(zhì)表面可見粗糙的粘接界面，球鉆組表面見少量粗糙的突起物，直接涂布全酸蝕粘接系統(tǒng)后所有組表面均見均勻的粘接界面，而在自酸蝕粘接系統(tǒng)或磷酸蝕刻后涂布粘接劑時，相對于磷酸蝕刻后涂布全酸蝕粘接系統(tǒng)，自酸蝕粘接系統(tǒng)或直接涂布全酸蝕粘接系統(tǒng)在與鉺激光處理后牙本質(zhì)結(jié)合中提供了更好的粘接性能。牙本質(zhì)粘接的基礎(chǔ)是形成混合層并產(chǎn)生微機械固位力。Ramos 等［9］得到全酸蝕粘接組粘接強度明顯低于自酸蝕組，推測可能是由于鉺激光處理后牙本質(zhì)膠原纖維變性融合，間隙縮小，影響磷酸接觸牙本質(zhì)，阻礙粘接劑滲透至脫礦全層。Oliveira 等［15］得到兩種自酸蝕粘接劑（clearfil protect bond，clearfil tri-s bond）粘接強度均高于全酸蝕粘接劑（single bond plus），且水保存6 個月后，粘接強度未降低，推測可能是由于兩種自酸蝕粘接劑均含有10-甲基丙烯酰氧基磷酸二氫（10-MDP），其與羥基磷灰石發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成穩(wěn)定持久的粘接。

Er：YAG 激光作為一種齲病治療的微創(chuàng)手段，有著良好的發(fā)展前景，但目前仍不能完全替代傳統(tǒng)牙科手機［16］，然而可以考慮作為現(xiàn)今牙本質(zhì)表面處理方式的替代，以往研究總體上都證實牙本質(zhì)表面粘接性能的提升可以由Er：YAG 激光輻照來實現(xiàn)［17］。本研究證實，經(jīng)參數(shù)為100 mJ 及50 μs的Er：YAG 激光處理后，牙本質(zhì)表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，更有利于粘接，這種改變與鈣磷比例無顯著相關(guān)。深入研究Er：YAG 激光照射后牙本質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，本質(zhì)是為了探索適用于激光處理后牙本質(zhì)的粘接方法，進而提高牙本質(zhì)修復(fù)效率。本研究僅僅對激光照射牙本質(zhì)表層性狀進行了初步的研究，顯微硬度的提高是否更有利于粘接、牙本質(zhì)深層結(jié)構(gòu)的熱損傷機制以及其對后續(xù)粘接修復(fù)的影響還需進一步探索。